趙莎，鄭司浩，李進(jìn)瞳，劉美娟，林暉才，熊啟相，曾燕，王繼永*

1.中國中藥有限公司，北京 100195；2.國藥種業(yè)有限公司，北京 100035

金蕎麥為蓼科植物金蕎麥Fagopyrum dibotrys（D.Don）Hara 的干燥根莖，最早記載于《本草拾遺》，現(xiàn)收載于《中華人民共和國藥典》2020 年版一部，具有清熱解毒、排膿祛瘀之功效，用于肺癰吐膿、肺熱喘咳、乳蛾腫痛[1]。金蕎麥根莖中主要含有原矢車菊素、表兒茶素、沒食子酸、槲皮素、木犀草素等化合物[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，金蕎麥在抗菌消炎、抗氧化、調(diào)血脂、抗癌、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移及增強(qiáng)免疫力等方面具有明顯的藥理活性，為金蕎麥片、復(fù)方金蕎麥顆粒、威麥寧膠囊等多種抗癌藥和癌預(yù)防藥物的主要原料，也是急支糖漿的主要原料之一，可顯著改善呼吸道炎癥[3-5]。金蕎麥分布于我國黃河以南的多個省區(qū)，主要以云南、貴州、四川3 省的野生資源最為集中，但隨著生態(tài)環(huán)境的惡化與過度采挖等因素，野生金蕎麥資源逐年減少，因此被列為國家二級重點保護(hù)植物[6]。不同產(chǎn)地金蕎麥的總酚、鞣質(zhì)、表兒茶素含量有區(qū)別，質(zhì)量差異較大，進(jìn)行金蕎麥產(chǎn)地鑒別對于金蕎麥種質(zhì)資源鑒定具有重要意義[7-9]。

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）標(biāo)記是近年來發(fā)展起來的建立在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）基礎(chǔ)上的第二代分子標(biāo)記技術(shù)，具有共顯性及含量豐富、多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡單等優(yōu)點，在作物遺傳多樣性、基因定位、分子輔助標(biāo)記、遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定和純度鑒定等方面都有很高的應(yīng)用價值[10-11]。詹海仙等[12]通過12對引物對不同產(chǎn)地甘草進(jìn)行區(qū)分，可用于甘草種質(zhì)資源的鑒定分析。目前，利用SSR 標(biāo)記技術(shù)分析蕎麥遺傳多樣性的研究多以甜蕎、苦蕎為研究對象[13-14]，以金蕎麥為研究對象的研究鮮有報道。本研究基于金蕎麥全基因組設(shè)計SSR 標(biāo)記引物，對來自云南、貴州、四川等地的野生金蕎麥樣本進(jìn)行遺傳多樣性及聚類分析，篩選用于鑒別不同產(chǎn)區(qū)野生金蕎麥種質(zhì)資源的引物組合，以期為金蕎麥種質(zhì)資源保護(hù)、開發(fā)及分子標(biāo)記輔助育種等提供參考。

1 材料

野生金蕎麥樣品共35 批分別采自云南、貴州、四川地區(qū)，采集根莖活體移栽至位于云南省昆明市的中國中藥有限公司金蕎麥野生種質(zhì)資源圃，并于2020 年6 月采集當(dāng)年萌發(fā)的鮮葉，硅膠干燥保存，由國藥種業(yè)有限公司李進(jìn)瞳副主任藥師鑒定為金蕎麥Fagopyrum dibotrys（D.Don）Hara。具體樣品信息見表1。

表1 金蕎麥樣品信息

T100 型PCR 儀、GelDocXR+型凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）；DYY-6D 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；1-14 型離心機(jī)（德國Sartorius 公司）；NanoDrop One 型超微量分光光度計（美國Thermo公司）。

異丙醇（批號：20190605）、無水乙醇（批號：20190507）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TaqDNA 聚合酶（批號：W9205a）、10×TaqBuffer（批號：U8402a）均購自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（批號：DC011，北京金百特生物技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 基因組DNA提取

利用十六烷基三甲基溴化銨法（mCTAB）提取金蕎麥樣本葉片的總DNA：取野生金蕎麥樣本葉片約100 mg，浸入液氮冷凍研磨至細(xì)小粉末；加入buffer A[0.1 mol·L-1三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl），pH 8.0；5 mmol·L-1乙 二 胺 四 乙 酸（EDTA）；0.25 mol·L-1氯化鈉（NaCl）；1%聚乙烯吡咯烷酮40（PVP-40）]1.5 mL，反復(fù)顛倒離心混勻，冰浴10 min，10 000×g離心10 min，棄上清液；在沉淀中加入buffer A 1.5 mL，反復(fù)顛倒離心混勻，冰浴10 min，10 000×g離心10 min，棄上清液。在沉淀中加入預(yù)熱的2% CTAB（0.1 mol·L-1Tris-HCl，pH 8.0；1.4 mol·L-1NaCl；25 mmol·L-1EDTA；2%CTAB；0.2%β-巰基乙醇；1%PVP-40）溶液800 μL，將沉淀均質(zhì)懸浮于溶液后置于65 ℃水浴鍋中保存1.5～2.0 h，期間顛倒均質(zhì)溶液3～5 次。將混合液放至室溫，10 000×g離心5 min，取上清液，加入等體積CI 溶液（三氯甲烷-異戊醇24∶1），在顛倒搖床上混合10 min，10 000×g離心5 min，取上清液，加入等體積CI 溶液，在顛倒搖床上混合10 min?；旌弦?0 000×g離心5 min，取上清液至1.5 mL 離心管中，加入0.6 倍體積冷的異丙醇，顛倒混合后置于-20 ℃冰箱保存1 h以上，10 000×g離心2 min，棄上清液，得到凝固體。將離心管倒置于干燥紙上盡量控干液滴，加入RNase 溶液（100 mg·L-1）100 μL，37 ℃保存0.5 h，依次加入雙蒸水（ddH2O）150 μL，5 mol·L-1NaCl 50 μL 和無水乙醇700 μL，充分混合后10 000×g離心2 min，棄上清液，將離心管倒置于干燥紙上盡量控干液滴，加入70%乙醇600 μL，混合后10 000×g離心2 min，棄上清液。再次加入70%乙醇600 μL，混合后10 000×g離心2 min，棄上清液，干燥除去乙醇，加TE緩沖液100 μL溶解，得到DNA溶解液。

將金蕎麥葉片的總DNA 進(jìn)行純化，用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒進(jìn)行操作，得到純化的DNA 溶解液，應(yīng)用NanoDrop One 型超微量分光光度計檢測DNA濃度，稀釋至50 ng·μL-1，待后續(xù)PCR擴(kuò)增使用。

2.2 SSR引物設(shè)計

從本課題組破譯的金蕎麥全基因組高通量數(shù)據(jù)中篩選出6935 對SSR 引物。在SSR 核心區(qū)側(cè)翼序列中（150 bp 范圍），使用primer 3 進(jìn)行primer 引物設(shè)計，引物最佳長度為24 bp；引物最小長度為20 bp；引物最大長度為28 bp；最佳退火溫度為63 ℃；最低退火溫度為60 ℃；最高退火溫度為65 ℃；1對引物退火溫度的最大差值為1 ℃。其他參數(shù)采用primer 3 的默認(rèn)參數(shù)。將引物BLAST 比對回基因組上，將成對引物在基因組上可以擴(kuò)增得到的序列長度進(jìn)行比較，與含有目標(biāo)SSR 的產(chǎn)物長度差在2 kb以上，保留該對引物，與含SSR 產(chǎn)物長度差在2 kb以下則濾掉該引物，最終即可得到SSR 候選引物。篩選出來的SSR 候選引物中，選擇重復(fù)單元（堿基序列）堿基數(shù)2～5 bp、重復(fù)單元（堿基序列）重復(fù)5～10 次的引物進(jìn)行預(yù)試驗。所選擇的引物長度為20～25 bp，理論退火溫度在55 ℃左右，PCR 產(chǎn)物長度為150～350 bp。

2.3 PCR擴(kuò)增及電泳檢測

用篩選出的引物對金蕎麥DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL：10×TaqBuffer 2 μL，2 mmol·L-1脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）2 μL，5 μmol·L-1引物對各1 μL，1.0 UTaqDNA 聚合酶0.2 μL，50 ng·μL-1DNA 模板2 μL，加滅菌雙蒸水至20 μL。設(shè)置未加模板DNA 的PCR 反應(yīng)為陰性對照。反應(yīng)程序：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s；退火30 s（JQM03、JQM04 退火溫度為56 ℃，JQM07、JQM21 退火溫度為58 ℃，JQM19 退火溫度為54 ℃）；72 ℃，1 min，32個循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否有條帶、片段大小是否合適，以確認(rèn)實驗是否成功。將檢驗成功的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測分型，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分型結(jié)果。

2.4 數(shù)據(jù)分析

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的分型結(jié)果用GeneMarker 4.0進(jìn)行峰圖判讀，以“0，1”二元方式來記錄等位基因片段大小，即某一等位基因存在時記為1，某一等位基因不存在時記0，缺失數(shù)據(jù)記為-9，從而得到等位基因矩陣，并通過GenALEx 計算金蕎麥在每個產(chǎn)地、個體間的遺傳多樣性數(shù)據(jù)。基于GenALEx計算所得的個體遺傳距離矩陣，通過MEGA 進(jìn)行UPGMA聚類分析，構(gòu)建聚類樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 引物篩選

利用不同產(chǎn)地的金蕎麥樣本對設(shè)計的SSR 引物開展預(yù)試驗，從擴(kuò)增成功率及多態(tài)性（毛細(xì)管熒光電泳方式）2個維度進(jìn)行引物的篩選，最終選定5對多態(tài)性好、擴(kuò)增成功率高的SSR 分子標(biāo)記引物，引物信息見表2。JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21 這5 對引物對四川產(chǎn)地的金蕎麥擴(kuò)增成功率高，JQM04、JQM07、JQM19、JQM21 這4 對引物對貴州產(chǎn)地的金蕎麥擴(kuò)增成功率高。

表2 金蕎麥產(chǎn)地鑒別SSR引物篩選

3.2 不同產(chǎn)區(qū)金蕎麥遺傳多樣性分析

3.2.1 四川地區(qū)金蕎麥遺傳多樣性分析 基于金蕎麥SSR 引物組合JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21得到各居群的遺傳多樣性參數(shù)見表3，結(jié)果顯示，3個居群觀測等位基因數(shù)（Na）為2.400～8.200，有效等位基因數(shù)（Ne）為2.236～5.727，Shannon′s指數(shù)（I）為0.739～1.768，其中四川居群的等位基因均值最低，相應(yīng)的I也較低。云南居群、貴州居群的觀測雜合度（Ho）≈期望雜合度（He），表明該居群比較符合客觀狀態(tài)；四川居群Ho＞He，表明該居群可能存在一定的雜種選擇現(xiàn)象或者遠(yuǎn)交現(xiàn)象。

表3 基于引物組合JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21的不同產(chǎn)地野生金蕎麥遺傳多樣性分析

3.2.2 貴州地區(qū)金蕎麥遺傳多樣性分析 基于金蕎麥SSR 引物組合JQM04、JQM07、JQM19、JQM21得到各居群的遺傳多樣性參數(shù)見表4，結(jié)果顯示，3 個居群Na為4.750～6.750，Ne為2.650～3.590，I為1.189～1.499，其中貴州居群的等位基因均值最低，相應(yīng)的I也較低。云南、四川居群Ho＜He，表明該居群可能存在一定的近交現(xiàn)象或者有雜合缺失未檢測到的情況；貴州居群Ho＞He，表明該居群可能存在一定的雜種選擇現(xiàn)象或者遠(yuǎn)交現(xiàn)象。

表4 基于引物組合JQM04、JQM07、JQM19、JQM21的不同產(chǎn)地野生金蕎麥遺傳多樣性分析

3.3 聚類結(jié)果分析

3.3.1 四川地區(qū)金蕎麥鑒定 基于金蕎麥SSR引物組 合QM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21，通過GenALEx計算各居群間遺傳相似性系數(shù)（表5）。由表5 可知，3 個居群間平均遺傳相似性系數(shù)為0.472，其中云南居群與貴州居群的遺傳相似性系數(shù)最大為0.769，說明云南、貴州居群的種群關(guān)系近，四川與云南、貴州居群的遺傳相似性系數(shù)分別為0.333、0.313，說明四川與云南、貴州居群種群關(guān)系相對更遠(yuǎn)?；贕enALEx 計算所得的遺傳多樣性數(shù)據(jù)，通過MEGA 進(jìn)行UPGMA 聚類分析，構(gòu)建聚類樹（圖1）可知，只有四川居群的聚為較純的一支，其他分支都有不同程度的混雜情況，同時也說明基于金蕎麥SSR 引物組合JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21 可以較好地對產(chǎn)地為四川產(chǎn)地的金蕎麥進(jìn)行區(qū)分鑒定。

表5 基于引物組合JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21的各居群間遺傳相似性系數(shù)

圖1 基于引物組合JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21的不同產(chǎn)地金蕎麥樣品的UPGMA聚類樹

3.3.2 貴州地區(qū)金蕎麥鑒定 基于金蕎麥SSR 引物組合JQM04、JQM07、JQM19、JQM21，通 過GenALEx 計算各居群間遺傳相似性系數(shù)（表6）。通過表6 可知，居群間平均遺傳相似系數(shù)為0.455，其中云南與貴州居群的遺傳相似系數(shù)最大為0.644，說明云南、貴州居群的種群關(guān)系近；四川與云南、貴州居群的遺傳相似系數(shù)分別為0.413、0.308，說明四川與云南、貴州兩居群種群關(guān)系相對更遠(yuǎn)?；贕enALEx 計算所得的遺傳多樣性數(shù)據(jù)，通過MEGA 進(jìn)行UPGMA 聚類分析，構(gòu)建聚類樹（圖2）可知，只有貴州居群的聚為較純的一支，其他分支都有不同程度的混雜情況，同時也說明基于金蕎麥SSR引物組合JQM04、JQM07、JQM19、JQM21可以較好地對產(chǎn)地為貴州產(chǎn)地的金蕎麥進(jìn)行區(qū)分鑒定。

圖2 基于引物組合JQM04、JQM07、JQM19、JQM21的不同產(chǎn)地金蕎麥樣品的UPGMA聚類樹

表6 基于引物組合JQM04、JQM07、JQM19、JQM21的各居群間遺傳相似性系數(shù)

4 討論

我國西南地區(qū)是國際公認(rèn)的蕎麥起源中心，也是遺傳多樣性中心[15]。張春平等[16]采用隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)對重慶市7 個野生金蕎麥居群的87 個個體進(jìn)行遺傳多樣性分析，得出金蕎麥種內(nèi)有豐富的遺傳多樣性，且與地理因素有顯著相關(guān)性。鄧蓉等[17]應(yīng)用簡單序列重復(fù)間區(qū)（ISSR）標(biāo)記方法，對貴州省內(nèi)11 個不同地域的金蕎麥種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析，得出種質(zhì)間遺傳差異較小且相對穩(wěn)定，為金蕎麥品種ISSR 指紋圖譜建立、種質(zhì)資源鑒定、基因定位等工作提供科學(xué)依據(jù)。程成等[6]使用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、matK分子標(biāo)記手段，對收集的云南省內(nèi)金蕎麥進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，結(jié)果表明海拔是影響其分類的主要因素。

本研究首次基于金蕎麥全基因組數(shù)據(jù)設(shè)計SSR標(biāo)記引物，對來自云南、貴州、四川3 個不同產(chǎn)地金蕎麥樣本進(jìn)行遺傳多樣性及聚類分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的金蕎麥具有豐富的遺傳多樣性，云南、貴州居群的種群關(guān)系近，四川與云南、貴州兩居群種群關(guān)系相對更遠(yuǎn)。引物組合JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21 可以對產(chǎn)地為四川的金蕎麥進(jìn)行鑒定區(qū)分；引物組合JQM04、JQM07、JQM19、JQM21 可以對產(chǎn)地為貴州的金蕎麥進(jìn)行鑒定區(qū)分；引物組合JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21 可成功對云南產(chǎn)地金蕎麥進(jìn)行擴(kuò)增，但可能由于云南產(chǎn)地的金蕎麥混雜較為嚴(yán)重，目前無法從產(chǎn)地將其區(qū)分開。后續(xù)研究將繼續(xù)加大樣本量，驗證并篩選更多、更穩(wěn)定的SSR 標(biāo)記引物，為金蕎麥種質(zhì)資源鑒定、保護(hù)，遺傳多樣性分析和金蕎麥新品種選育提供更多的參考依據(jù)。