呂菲菲，楊云，孫佩文，馮劍，劉培衛(wèi)，劉洋洋，徐艷紅*，魏建和，*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 海南分所/海南省南藥資源保護與開發(fā)重點實驗室/國家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點研究室，海南 ?？?570311；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

沉香是 瑞香科（Thymelaeaceae）沉 香屬（AquilariaLam.）或擬沉香屬植物傷害誘導(dǎo)防御反應(yīng)形成的含樹脂木材，是中國的傳統(tǒng)名貴中藥，廣泛應(yīng)用于中成藥、藏藥和日本漢方藥中[1-2]。因具有獨特的芳香氣味，沉香也被廣泛用于熏香香料行業(yè)，是高級香水香料的定香劑[3]。奇楠被認(rèn)為是品質(zhì)優(yōu)良的沉香，外表油潤光滑，香味醇厚，味微苦、麻、辣、清涼[4]。中國產(chǎn)的奇楠沉香以野生采挖為主[5]，香農(nóng)在野外采香的過程中發(fā)現(xiàn)某些白木香樹經(jīng)輕微傷害后可以持續(xù)地形成奇楠沉香，但這種優(yōu)良性狀很難通過有性繁殖而延續(xù)。近年來，香農(nóng)將采挖的野生奇楠沉香樹木進行嫁接擴繁，獲得了可穩(wěn)定遺傳的奇楠種質(zhì)，通過鉆孔法傷害成功地生產(chǎn)了奇楠沉香，由奇楠種質(zhì)生產(chǎn)的奇楠沉香已流通于市場。

倍半萜是沉香的主要成分之一，只有受傷害后才會在莖干、枝條和根內(nèi)大量合成，其組成和含量決定了沉香的藥用價值和芳香氣味[6]。奇楠種質(zhì)生產(chǎn)的奇楠沉香顏色重、油性大、香味獨特，明顯不同于普通白木香生產(chǎn)的沉香，可見2 種種質(zhì)生產(chǎn)的沉香中倍半萜組分和含量有所不同，但倍半萜合成差異的分子調(diào)控機制尚缺乏研究。倍半萜合酶是白木香傷害誘導(dǎo)合成倍半萜的關(guān)鍵催化酶，其活性受基因表達調(diào)控[7]。健康白木香中倍半萜合酶幾乎不表達，外界傷害刺激后，才會被激活誘導(dǎo)表達[8]，倍半萜合酶基因表達一定程度上決定了白木香受到傷害后倍半萜合成的種類和含量?；诖耍狙芯恳砸环N生產(chǎn)上的奇楠種質(zhì)和普通白木香種質(zhì)為研究對象，分析2 種種質(zhì)所結(jié)沉香倍半萜組分的差異，以及傷害早期顯著響應(yīng)的7 個倍半萜合酶基因（AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS18、AsTPS20、AsTPS23）誘導(dǎo)表達模式，初步分析這2 種種質(zhì)傷害誘導(dǎo)形成倍半萜差異的機制，也為沉香優(yōu)良結(jié)香種質(zhì)的鑒定和篩選、結(jié)香分子機制的解析提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

奇楠種質(zhì)及其所結(jié)沉香取自廣東省茂名市電白區(qū)觀珠鎮(zhèn)，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所采用DNA boarding 技術(shù)鑒定為白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg。普通白木香種質(zhì)及其所結(jié)沉香取自海南省?？谑兄袊t(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所?？谘邪l(fā)中心。

乙醚（西隴科學(xué)股份有限公司）；液氮（純度＞99.99%，海南佳騰化工氣體有限公司）；EASY-spin plus RN38型植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）；TransScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、TransStart?Top Green qPCR SuperMix、瓊脂糖均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

XPE 105 型電子天平（梅特勒-托利多公司）；7890A型氣相色譜-質(zhì)譜儀（安捷倫公司）；Nano Drop 2000C 超微量分光光度計（賽默飛世爾科技公司）；LightCycler?96 型實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）儀（霍夫曼·羅氏公司）；SB25-12DTDN型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；MiniVac Beta 型真空離心濃縮干燥機（Labogene 公司）；ChemiDoc?XRS+型凝膠成像儀（Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 倍半萜提取與測定

沉香倍半萜提取參考文獻［9］方法，準(zhǔn)確稱取結(jié)香2 年沉香0.5 g，液氮研磨成粉，向粉末中加入乙醚5 mL，冰浴超聲提取30 min，靜置5 min，收集上清液備用。向沉淀中再次加入乙醚5 mL，重復(fù)提取2 次，合并3 次收集的上清液，真空旋轉(zhuǎn)干燥，向干燥物中加入乙醚1 mL 溶解，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過后，氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）測定化學(xué)組分。

GC 分析條件：毛細(xì)管柱為HP-5MS 5% Phenyl Silox（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣為氦氣；柱體積流量為1.0 mL·min-1，不分流；進樣口溫度為240 ℃；升溫程序：初始柱溫60 ℃，保持2 min，5 ℃·min-1升至250 ℃，保持10 min，共運行50 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI）；電子能為70 eV；離子源溫度為230 ℃；四級桿溫度為150 ℃；質(zhì)量掃描范圍為m/z50～300。

2.2 莖干總RNA提取和cDNA合成

選取3 年生健康莖干，直徑為（1.2±0.2）cm，對莖干進行全斷干傷害處理，并分別在傷害后0、2、6、24 h 截取傷口處2 cm 莖干（傷害誘導(dǎo)結(jié)香早期0～24 h 是傷害信號傳遞、防御反應(yīng)啟動、基因誘導(dǎo)表達相對最活躍階段），立即投入液氮中冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

全斷干傷害處理莖干經(jīng)液氮研磨成粉，按照試劑盒說明書提取莖干總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，測定RNA 濃度。取所提取的RNA 約500 ng，根據(jù)要求反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，作為qRT-PCR模版。測定cDNA濃度。

2.3 qRT-PCR檢測基因表達

根據(jù)本課題組白木香全基因組注釋的倍半萜合酶基因序列，采用Primer 5.0 軟件設(shè)計特異性引物（表1），由廣州艾基生物有限公司合成，所有引物經(jīng)PCR擴增后，產(chǎn)物由廣州艾基生物有限公司測序驗證。

qRT-PCR 檢測基因表達量：20 μL PCR 體系包含Mix enzyme 10 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各1 μL，反轉(zhuǎn)錄所得cDNA 1 μL 和雙蒸水（ddH2O）7 μL。qRT-PCR 擴增程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，按不同基因引物退火溫度退火15 s（表1），72 ℃延伸20 s，共40 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。實驗設(shè)定3 個重復(fù)。以三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參[10]，將qRT-PCR 所得的樣品Ct值利用2-ΔΔCt方法轉(zhuǎn)化為基因相對表達量值。使用SPSS 1.1.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對檢測結(jié)果進行單樣本t檢驗顯著性分析，結(jié)果以（-x±s）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 沉香倍半萜合酶基因引物和擴增片段

3 結(jié)果與分析

3.1 倍半萜類成分差異

GC-MS 測定后，將測得的化合物與NIST 數(shù)據(jù)庫比對，對匹配度＞75%的21個倍半萜及其衍生物進行對比分析，發(fā)現(xiàn)普通白木香所結(jié)的沉香中有17個，奇楠沉香中有16 個，在奇楠沉香中檢測到的香橙烯、檸檬烯、α-馬欖烯、石竹烯4個倍半萜類化合物在普通白木香結(jié)的沉香中沒有檢測到，而普通白木香所結(jié)沉香中存在的蛇麻烯、（-）-馬兜鈴烯、別香橙烯、長葉醛、香橙烯氧化物1 也沒有在奇楠沉香中檢測到，可見2 種種質(zhì)所結(jié)沉香倍半萜組分差異較大。對兩者共有成分相對含量進行對比分析，發(fā)現(xiàn)倍半萜及其衍生物在兩者中的相對含量也有所不同，如普通白木香所結(jié)沉香中α-檀香醇的相對含量是奇楠沉香的6 倍左右，而奇楠沉香中α-愈創(chuàng)木烯相對含量是普通白木香所結(jié)沉香的2 倍有余（表2），綜上，奇楠沉香和普通白木香所結(jié)的沉香中倍半萜組分和含量差異明顯。

表2 普通白木香所結(jié)沉香和奇楠沉香中倍半萜及其衍生物對比（, n=3）

表2 普通白木香所結(jié)沉香和奇楠沉香中倍半萜及其衍生物對比（, n=3）

注：根據(jù)Duncan′s多區(qū)間統(tǒng)計分析，上標(biāo)不同字母代表各組間P＜0.05。

3.2 倍半萜合酶基因檢測

提取莖干的總RNA，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測明顯有18S 和28S 2 條帶，條帶清晰，無拖尾，28S/18S 約為1.5（圖1），說明提取的莖干總RNA 質(zhì)量較好，經(jīng)反轉(zhuǎn)后可用于后續(xù)qRT-PCR檢測。

圖1 2種白木香莖干總RNA凝膠電泳

根據(jù)白木香全基因組（PRJNA524272）及前期白木香倍半萜合酶基因誘導(dǎo)表達模式[11]分析發(fā)現(xiàn)，傷害誘導(dǎo)結(jié)香早期顯著響應(yīng)的倍半萜合酶基因主要為AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS18、AsTPS20、AsTPS23。經(jīng)PCR 擴增，擴增條帶大小與設(shè)計引物得到的片段大小基本一致（圖2）。將PCR產(chǎn)物測序，所得結(jié)果進行BLAST 比對，所有序列比對結(jié)果均符合全基因組注釋結(jié)果，即所有擴增產(chǎn)物為倍半萜合酶的DNA序列。

圖2 7個倍半萜合酶基因在傷害處理白木香莖干中PCR擴增條帶

3.3 普通白木香倍半萜合酶基因傷害早期誘導(dǎo)表達

對已驗證序列的7個傷害早期誘導(dǎo)表達倍半萜合酶基因進行了qRT-PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)普通白木香AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS18、AsTPS20、AsTPS23基因均響應(yīng)于傷害誘導(dǎo)，傷害24 h 內(nèi)基因表達量均先上升，2 h 達到最大值后下降，誘導(dǎo)表達最大相對倍數(shù)均在幾十倍到幾百倍，誘導(dǎo)表達強度明顯（圖3），說 明AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS18、AsTPS20、AsTPS23均強烈響應(yīng)于普通白木香的早期傷害誘導(dǎo)，且誘導(dǎo)表達模式基本一致，呈先上升后下降的態(tài)勢。

圖3 不同傷害處理時間對普通白木香種質(zhì)中7個倍半萜合酶基因誘導(dǎo)表達水平的影響（, n=3）

3.4 奇楠種質(zhì)倍半萜合酶基因傷害早期誘導(dǎo)表達

經(jīng)qRT-PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)除AsTPS18基因外，奇楠 種質(zhì)中的AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS20、AsTPS23基因也都響應(yīng)于傷害刺激，但各基因響應(yīng)傷害誘導(dǎo)的表達模式不同，AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17和AsTPS23基因在傷害誘導(dǎo)24 h 內(nèi)表達逐漸增強，基因表達量呈遞增態(tài)勢，AsTPS20則呈現(xiàn)先上升后下降的表達趨勢，傷害誘導(dǎo)6 h 表達量最高，這6 個倍半萜合酶基因傷害誘導(dǎo)24 h 內(nèi)最大表達相對倍數(shù)集中于十幾倍到幾十倍，與普通白木香相比誘導(dǎo)響應(yīng)強度較低（圖4）。AsTPS18基因在傷害誘導(dǎo)24 h 內(nèi)表達不明顯，6 h 達到最大表達量，僅為3.60，遠(yuǎn)低于普通白木香中的誘導(dǎo)相對表達量，其在奇楠種質(zhì)中可能不是早期響應(yīng)傷害的倍半萜合酶基因。說明除AsTPS18外，其余6 個倍半萜合酶基因在奇楠種質(zhì)中均在傷害誘導(dǎo)結(jié)香早期有所響應(yīng)，但與普通白木香中的基因誘導(dǎo)表達模式不一致，誘導(dǎo)表達強度相對普通白木香較低。

圖4 不同傷害處理時間對奇楠種質(zhì)中7個倍半萜合酶基因表達水平的影響（, n=3）

3.5 健康奇楠種質(zhì)與普通白木香倍半萜合酶基因表達分析

為了進一步探索2 種種質(zhì)的差異，對比了奇楠種質(zhì)和普通白木香健康莖干內(nèi)倍半萜合酶基因表達情況（圖5），發(fā)現(xiàn)普通白木香種質(zhì)中響應(yīng)早期傷害的7 個倍半萜合酶基因在健康莖干中幾乎不表達，而奇楠種質(zhì)中除AsTPS2與AsTPS20外，AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS23和AsTPS18表達明顯，且高于健康白木香，說明健康的奇楠種質(zhì)和普通白木香中倍半萜合酶基因的表達也存在明顯差異。

圖5 奇楠種質(zhì)和普通白木香健康莖干內(nèi)7個倍半萜合酶基因表達對比（, n=3）

4 討論

倍半萜是沉香的主要成分之一，其含量和組分在一定程度上決定了沉香的含油量和香味[4,12]。目前，奇楠種質(zhì)生產(chǎn)的奇楠沉香含油量高，香味醇厚，品質(zhì)明顯高于普通白木香種質(zhì)所結(jié)沉香。為了探索2種種質(zhì)結(jié)香差異及篩選優(yōu)良種質(zhì)，本研究選取一種市面上大量推廣嫁接的奇楠種質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其生產(chǎn)的奇楠沉香與普通白木香所結(jié)沉香的倍半萜組分有所不同，且共有組分含量差異也較大，說明在相同傷害下，奇楠種質(zhì)和普通白木香種質(zhì)誘導(dǎo)合成沉香倍半萜的分子調(diào)控機制存在差異，兩者倍半萜組分和含量的差異可能是奇楠沉香品質(zhì)優(yōu)于普通白木香種質(zhì)的關(guān)鍵原因。該發(fā)現(xiàn)與大麻不同品種間萜類組分不同的研究結(jié)果相一致[13]。

倍半萜是沉香屬植物受傷害后形成的次生代謝產(chǎn)物，植物中多種因子協(xié)同調(diào)控其合成[14-17]。倍半萜合酶就是倍半萜合成的關(guān)鍵催化酶，可催化法呢烯焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）形成不同的倍半萜骨架[7]。本研究發(fā)現(xiàn)普通白木香種質(zhì)中傷害誘導(dǎo)結(jié)香早期顯著誘導(dǎo)高表達的AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS20、AsTPS23基因在奇楠種質(zhì)中響應(yīng)強度較低，而AsTPS18基因在奇楠種質(zhì)中幾乎不響應(yīng)于早期傷害誘導(dǎo)，可見倍半萜合酶基因誘導(dǎo)表達機制在奇楠種質(zhì)和普通白木香種質(zhì)中差異顯著，表明2 種種質(zhì)傷害后啟動防御反應(yīng)的機制有所不同，致使誘導(dǎo)合成倍半萜的組分和含量不同。此外，還發(fā)現(xiàn)AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS23和AsTPS18基因在健康奇楠種質(zhì)中表達量顯著高于健康白木香，說明奇楠種質(zhì)中倍半萜合酶基因表達更為敏感，這可能是盛傳的奇楠種質(zhì)不傷害也能產(chǎn)生奇楠沉香的原因。倍半萜合酶基因的差異表達機制是奇楠種質(zhì)和普通白木香種質(zhì)傷害誘導(dǎo)結(jié)香性能差異的關(guān)鍵調(diào)控機制，本研究首次從基因表達層面解析2 種種質(zhì)結(jié)香性能差異，對其深入研究有助于完善沉香形成機制，差異表達倍半萜合酶的篩選和論證將為新的分子標(biāo)記開發(fā)和沉香優(yōu)良結(jié)香種質(zhì)的鑒定提供參考。