周慶全, 徐 飛, 劉浩燕, 王宗站

(山東省青島市中心醫(yī)院, 1. 結(jié)直腸肛門外科, 2. 放療一科, 山東 青島, 266000)

結(jié)直腸癌是中國常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率與病死率逐年增高，結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移是造成患者預(yù)后不良的重要原因。長鏈非編碼RNA(LncRNA)在結(jié)直腸癌發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，可通過調(diào)控微小RNA(miRNA)發(fā)揮作用[1-4]。LncRNA T-box轉(zhuǎn)錄因子5反義RNA 1(TBX5-AS1)在非小細(xì)胞肺癌組織與細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。但TBX5-AS1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制尚未可知。LncBase Predicted v. 2預(yù)測軟件顯示TBX5-AS1與miR-92a-3p存在結(jié)合位點，研究[6]表明miR-92a在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。但TBX5-AS1與miR-92a-3p在結(jié)直腸癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未闡明。本研究探討TBX5-AS1是否可通過調(diào)控miR-92a-3p而調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集2019年1月—2020年8月在本院接受手術(shù)治療的37例結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)癌旁組織，其中男20例，女17例，年齡52～71歲，平均(63.26±7.44)歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。材料與試劑包括: 人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116購自上海弘順生物; DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipofectamine2000、Trizol試劑購自美國Thermo Fisher; 逆轉(zhuǎn)錄試劑與SYBR Green qPCR MasterMix試劑購自北京天根生化科技公司; miR-NC、miR-92a-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-92a-3p、pcDNA、pcDNA-TBX5-AS1購自上海吉瑪; MTT、Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠購自北京索萊寶; Dual-Luciferase Reporter Assay Kit試劑購自美國Promega; 兔抗人E-cadherin、N-cadherin、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體與二抗購自美國Abcam。StepOnePlus實時熒光定量PCR儀購自美國ABI; 酶標(biāo)儀、電泳儀與凝膠成像系統(tǒng)購自美國Thermo Fisher; 離心機(jī)與電泳槽購自北京六一生物。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組: 取HCT116細(xì)胞(1×105個/mL)接種于6孔板(200 μL/孔)，采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑分別將pcDNA、pcDNA-TBX5-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-92a-3p、miR-NC、miR-92a-3p mmics、pcDNA-TBX5-AS1與miR-92a-3p mmics轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞，分別記為pcDNA組、pcDNA-TBX5-AS1組、anti-miR-NC組、anti-miR-92a-3p組、miR-NC組、miR-92a-3p組、pcDNA-TBX5-AS1+miR-92a-3p組。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測TBX5-AS1、miR-92a-3p的表達(dá)水平: 采用Trizol試劑分別提取結(jié)直腸癌組織、癌旁組織和各組HCT116細(xì)胞總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照SYBR Green qPCR MasterMix試劑說明書對TBX5-AS1、miR-92a-3p的表達(dá)量進(jìn)行檢測, TBX5-AS1以GAPDH為內(nèi)參,miR-92a-3p以U6為內(nèi)參。反應(yīng)體系: SYBR Green Mix 10.0 μL, cDNA 2.0 μL, 上下游引物各0.5 μL, RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20.0 μL; 反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性2 min, 95 ℃變性30 s, 59 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共40次循環(huán)，用2-ΔΔCt法計算TBX5-AS1、miR-92a-3p相對表達(dá)量。

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞增殖: 取對數(shù)生長期HCT116細(xì)胞接種于96孔板(5×103個/孔)，按照1.2.1方法分組處理后，分別在培養(yǎng)24、48、72 h時向每孔加入20.0 μL MTT溶液，于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入150.0 μL二甲基亞砜(DMSO), 室溫避光振蕩孵育5 min, 應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值。

1.2.4 平板克隆形成實驗: 取各組HCT116細(xì)胞接種于6孔板，密度為每孔1×104個細(xì)胞，每隔2 d更換1次培養(yǎng)液，直至細(xì)胞出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，加入4%多聚甲醛固定15 min后進(jìn)行結(jié)晶紫染色5 min, PBS洗滌后晾干，觀察克隆形成細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 劃痕實驗: 實驗前采用記號筆在6孔板后面每隔0.5 cm劃橫線，各組HCT116細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期后按照每孔1×105個接種于6孔板，于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h, 待細(xì)胞鋪滿后采用20.0 μL移液槍的槍頭垂直于橫線劃痕, PBS洗滌后加入不含胎牛血清的培養(yǎng)基，于200倍鏡下拍照記錄0 h時劃痕位置與寬度，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后于200倍鏡下拍照記錄，檢測細(xì)胞遷移距離。

1.2.6 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲: 取各組HCT116細(xì)胞用胰蛋白酶消化后吹打混勻, 1 000 轉(zhuǎn)/min離心3 min后，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞(2×104個/mL), 取200.0 μL細(xì)胞懸液接種于平鋪Matrigel基質(zhì)膠的上室，下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后采用PBS洗滌，多聚甲醛固定20 min, 0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min, 200倍顯微鏡下觀察并計算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測TBX5-AS1和miR-92a-3p的靶向關(guān)系: 根據(jù)靶基因預(yù)測軟件預(yù)測TBX5-AS1和miR-92a-3p可能的結(jié)合位點，體外合成該位點的DNA片段(wt-TBX5-AS1)及包含該位點突變體的DNA片段(mut-TBX5-AS1), 將其克隆至雙熒光素酶啟動子載體PGL3, 將報告質(zhì)粒分別與miR-NC或miR-92a-3p mimics共轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后采用試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.8 Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá): 轉(zhuǎn)染后各組HCT116細(xì)胞采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，加入10%SDS-PAGE分離蛋白，凝膠電泳時電壓80 V, 電流調(diào)整至最大，恒壓條件下跑膠2.5 h, 采用電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，電流調(diào)整至最大，電壓80 V轉(zhuǎn)膜1 h, PVDF膜轉(zhuǎn)移至5%脫脂奶粉中封閉1 h, 向其中加入1∶1 000稀釋的E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9、GAPDH, 于4 ℃孵育24 h, TBST洗滌，加入1∶5 000稀釋的二抗，室溫封閉1 h, 加入ECL化學(xué)發(fā)光液，采用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 TBX5-AS1和miR-92a-3p表達(dá)的檢測

與癌旁組織比較，結(jié)直腸癌組織中TBX5-AS1的表達(dá)量降低, miR-92a-3p的表達(dá)量升高; 與pcDNA組比較, pcDNA-TBX5-AS1組TBX5-AS1的表達(dá)量升高, miR-92a-3p的表達(dá)量降低; 與anti-miR-NC組比較, anti-miR-92a-3p組miR-92a-3p的表達(dá)量降低; 與miR-NC組比較, miR-92a-3p組miR-92a-3p的表達(dá)量升高; 與pcDNA-TBX5-AS1組比較, pcDNA-TBX5-AS1+miR-92a-3p組miR-92a-3p的表達(dá)量升高; 上述組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A: TBX5-AS1在結(jié)直腸癌組織(n=37)中的表達(dá),與癌旁組織比較, ?P<0.05; B: miR-92a-3p在結(jié)直腸癌組織(n=37)中的表達(dá),與癌旁組織比較, ?P<0.05; C: TBX5-AS1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá),與HIEC-6比較, ?P<0.05; D: miR-92a-3p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá),與HIEC-6比較, ?P<0.05; E: 干擾TBX5-AS1處理后TBX5-AS1的表達(dá),與pcDNA比較, ?P<0.05; F: 各個處理組細(xì)胞中miR-92a-3p的表達(dá),與pcDNA比較, ?P<0.05, 與anti-miR-NC比較, #P<0.05, 與miR-NC比較, △P<0.05, 與pcDNA-TBX5-AS1比較, ▲P<0.05。圖1 TBX5-AS1和miR-92a-3p的表達(dá)

2.2 MTT法和克隆形成實驗檢測各個處理組對HCT116增殖的影響

與pcDNA組比較, pcDNA-TBX5-AS1組細(xì)胞存活率降低，克隆形成數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與anti-miR-NC組比較, anti-miR-92a-3p組細(xì)胞存活率降低，克隆形成數(shù)減少; 與miR-NC組比較, miR-92a-3p組細(xì)胞存活率升高，克隆形成數(shù)增多; 與pcDNA-TBX5-AS1組比較, pcDNA-TBX5-AS1+miR-92a-3p組細(xì)胞存活率升高，克隆形成數(shù)增多; 上述組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖2、表1。

圖2 各個處理組對HCT116克隆形成的影響

表1 各個處理組對HCT116克隆形成的檢測

2.3 劃痕實驗和Transwell實驗檢測各個處理組對HCT116遷移、侵襲的影響

與pcDNA組比較, pcDNA-TBX5-AS1組遷移距離縮短，侵襲細(xì)胞數(shù)減少; 與anti-miR-NC組比較, anti-miR-92a-3p組遷移距離縮短，侵襲細(xì)胞數(shù)減少; 與miR-NC組比較, miR-92a-3p組遷移距離增加，侵襲細(xì)胞數(shù)增多; 與pcDNA-TBX5-AS1組比較, pcDNA-TBX5-AS1+miR-92a-3p組遷移距離增加，侵襲細(xì)胞數(shù)增多; 上述組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖3、圖4及表2。

圖3 各個處理組對HCT116遷移的影響

圖4 各個處理組對HCT116侵襲的影響

表2 各個處理組對HCT116遷移距離和侵襲細(xì)胞數(shù)的結(jié)果比較

2.4 雙熒光素酶報告實驗檢測TBX5-AS1和miR-92a-3p靶向關(guān)系

TBX5-AS1和miR-92a-3p存在結(jié)合位點，見圖5。共轉(zhuǎn)染wt-TBX5-AS1的細(xì)胞實驗中，與miR-NC組比較, miR-92a-3p組熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 共轉(zhuǎn)染mut-TBX5-AS1的細(xì)胞實驗中, miR-92a-3p組與miR-NC組熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見表3。

圖5 TBX5-AS1和miR-92a-3p的互補(bǔ)序列

表3 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果

2.5 Western檢測各個處理組對HCT116中蛋白的表達(dá)

與pcDNA組比較, pcDNA-TBX5-AS1組E-cadherin蛋白表達(dá)量升高, N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量降低; 與anti-miR-NC組比較, anti-miR-92a-3p組E-cadherin蛋白表達(dá)量升高, N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量降低; 與miR-NC組比較, miR-92a-3p組E-cadherin蛋白表達(dá)量降低, N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量升高; 與pcDNA-TBX5-AS1組比較, pcDNA-TBX5-AS1+miR-92a-3p組E-cadherin蛋白表達(dá)量降低, N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量升高; 上述組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖6、表4。

圖6 不同處理組E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)比較

表4 各個處理組對HCT116中E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)結(jié)果比較

3 討 論

結(jié)直腸癌具有發(fā)病率高、病死率高等特點, LncRNA包含保守序列，其調(diào)控基因表達(dá)的方式具有多樣性，主要是參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等過程，進(jìn)而在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，如LncRNA MAFG-AS1通過充當(dāng)miR-147b的競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)而激活NDUFA4, 進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展[7]。LncRNA-SNHG15通過抑制miR-338-3p而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖[8]。LncRNA BDNF-AS通過抑制GSK-3beta表達(dá)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移[9]。LncRNA NBR2通過下調(diào)miR-21而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲[10]。

TBX5-AS1在肺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌等腫瘤中表達(dá)異常，其表達(dá)量與患者預(yù)后不良有關(guān)[11-13]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中TBX5-AS1的表達(dá)量低于癌旁組織, TBX5-AS1過表達(dá)可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞活力，減少細(xì)胞克隆形成數(shù)，提示TBX5-AS1過表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及克隆形成。E-cadherin與N-cadherin是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白，其中E-cadherin表達(dá)失調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，而N-cadherin表達(dá)下調(diào)可抑制EMT轉(zhuǎn)化[14-15]。本研究結(jié)果顯示, TBX5-AS1過表達(dá)后結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移距離縮短，侵襲細(xì)胞數(shù)減少，并可促進(jìn)E-cadherin表達(dá)而抑制N-cadherin表達(dá)，提示TBX5-AS1過表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移及侵襲。

本研究證實結(jié)直腸癌細(xì)胞中TBX5-AS1可靶向結(jié)合miR-92a-3p, 并可負(fù)向調(diào)控miR-92a-3p的表達(dá)。研究[16]表明miR-92a-3p通過靶向KLF2促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。miR-92a-3p通過調(diào)節(jié)PTEN促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的增殖、遷移和侵襲[17]。miR-92a-3p通過靶向FBXW7而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖及遷移[18]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中miR-92a-3p的表達(dá)量高于癌旁組織，抑制miR-92a-3p表達(dá)能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲，而miR-92a-3p過表達(dá)可明顯促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及增強(qiáng)細(xì)胞克隆形成、遷移、侵襲能力，還可進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)TBX5-AS1過表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用，提示TBX5-AS1可通過靶向調(diào)控miR-92a-3p而調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中TBX5-AS1的表達(dá)量降低, miR-92a-3p的表達(dá)量升高, TBX5-AS1過表達(dá)可通過靶向調(diào)控miR-92a-3p的表達(dá)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲, TBX5-AS1或可作為結(jié)直腸癌的潛在治療靶點。