金雪寧, 林 飛, 馮心怡, 李 岑, 崔樹娜

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225000; 2. 揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225009)

絨毛膜癌(CC)簡(jiǎn)稱絨癌，屬于高度惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤，有50%的妊娠CC發(fā)生在葡萄胎之后，其余的發(fā)生在自然流產(chǎn)和人工流產(chǎn)、正常足月妊娠或早產(chǎn)以及異位妊娠之后[1-2]。目前常用的化療藥物有甲氨蝶呤、環(huán)磷酞胺等，但這些化療藥物毒副作用大。多西他賽與紫杉醇都屬于紫杉醇類藥物，但多西他賽抗腫瘤活性更高，抗癌譜更廣，其機(jī)制是加強(qiáng)微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，導(dǎo)致形成穩(wěn)定的非功能性微管束，因而破壞腫瘤細(xì)胞的有絲分裂[3], 在臨床中被廣泛應(yīng)用于治療難治性卵巢癌等[4-7]。作者的前期體外實(shí)驗(yàn)[8]證實(shí)多西他賽能抑制CC細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并明顯抑制其侵襲能力。研究[9]報(bào)道多西他賽能降低對(duì)常規(guī)化療藥物不敏感的CC患者血清人絨毛膜促性腺激素(HCG)水平，但多西他賽治療CC的作用機(jī)制還缺乏深入研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)和計(jì)算機(jī)信息學(xué)等多門學(xué)科，建立“藥物-成分-基因-靶點(diǎn)-通路-疾病”的多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，探索天然藥物與復(fù)雜疾病的相互關(guān)系[10-11]。本研究基于前期實(shí)驗(yàn)研究和臨床文獻(xiàn)結(jié)果，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段探索多西他賽治療CC的潛在作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 多西他賽、CC的靶點(diǎn)收集

在Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中分別以“Docetaxol” “choriocarcinoma”為關(guān)鍵詞檢索靶點(diǎn)，并將其導(dǎo)入Excel表格中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將多西他賽所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因和CC相關(guān)的靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，獲得兩者的共同基因，即多西他賽治療CC的作用靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選出的基因輸入String 11.0數(shù)據(jù)庫，將蛋白種類設(shè)置為人類(homo sapiens), “minimum required interaction score”參數(shù)設(shè)置為“highest confidence(0.900)”, 其余參數(shù)保持初始默認(rèn)設(shè)置，導(dǎo)出PPI數(shù)據(jù)文件，建立蛋白與蛋白之間的網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4 Hub基因篩選

通過Cytoscape軟件的Cytohubba插件中的MCC算法，計(jì)算并篩選排名前10位的多西他賽治療CC的Hub基因。

1.5 基因本體論(GO)富集和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集

將共同基因輸入DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫(http://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，研究多西他賽治療CC的關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物功能以及參與的信號(hào)通路，以P<0.05和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05作為篩選條件，篩選具有顯著差異的生物過程和靶點(diǎn)通路。

2 結(jié) 果

2.1 靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在Genecards數(shù)據(jù)庫分別以“Docetaxol”和“choriocarcinoma”為關(guān)鍵詞檢索靶點(diǎn)，分別獲得953和1 137個(gè)靶點(diǎn)，將1 137個(gè)疾病靶點(diǎn)與953個(gè)藥物靶點(diǎn)輸入Venny2.1 軟件繪制韋恩圖，篩選出294個(gè)共同靶點(diǎn)，見圖1。將共同靶點(diǎn)在String 11.0 平臺(tái)分析的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型。以Combined_score>0.9為篩選條件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，其中節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn)蛋白，邊為各蛋白間互作關(guān)系，節(jié)點(diǎn)連接邊數(shù)越多代表其在網(wǎng)絡(luò)中作用越重要，見圖2。通過Cytoscape 軟件插件Cytohubba計(jì)算排名前10位的Hub基因，其中TP53、AKT1、CASP8、STAT3等是多西他賽治療CC的關(guān)鍵基因。見圖3。

圖1 藥物和疾病靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 交集靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

圖3 通過MCC算法計(jì)算排名前10位的多西他賽治療CC的hub基因

2.2 GO功能和KEGG富集分析

將294個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。GO富集分析中，參與的生物過程有409個(gè)，主要包括調(diào)控細(xì)胞增殖(細(xì)胞增殖調(diào)節(jié))、細(xì)胞凋亡(細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控、細(xì)胞死亡的調(diào)控、程序性細(xì)胞死亡的調(diào)控)、信號(hào)傳導(dǎo)(信號(hào)傳導(dǎo)的正調(diào)控)、調(diào)節(jié)分子代謝(大分子代謝及合成過程的正調(diào)控、有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)等)。KEGG通路富集分析確定了28條相關(guān)信號(hào)通路，主要涉及癌癥通路、細(xì)胞凋亡通路、Focal Adhesion通路和p53、ErbB、MAPK等信號(hào)通路。見圖4、圖5。

圖4 多西他賽潛在靶點(diǎn)的富集分析(生物過程)

原點(diǎn)由小到大代表分值逐漸升高,靶點(diǎn)富集數(shù)目多,通路顯著性逐漸增強(qiáng); 顏色由藍(lán)變紅代表P值逐漸減小。圖5 多西他賽潛在靶點(diǎn)的KEGG通路注釋圖

3 討 論

CC屬于惡性滋養(yǎng)細(xì)胞癌，是由滋養(yǎng)層滋養(yǎng)細(xì)胞增殖引起的惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致這種轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制尚未確定。CC可繼發(fā)于葡萄胎妊娠，也可繼發(fā)于非葡萄胎妊娠，病情發(fā)展迅速，病死率高，主要通過血行播散，轉(zhuǎn)移早且易擴(kuò)散，肺是CC最易轉(zhuǎn)移的部位，其次為陰道、盆腔等，轉(zhuǎn)移部位皆有局部出血灶[1, 12]。

多西他賽也稱多西紫杉醇，是紫杉醇類化學(xué)藥物的衍生物，臨床應(yīng)用廣泛，常被用于治療難治性卵巢癌等，但其應(yīng)用于CC方面的研究較少[4-6]。作者前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，多西他賽可以抑制CC細(xì)胞增殖的能力，并能誘導(dǎo)CC細(xì)胞凋亡，其作用濃度與時(shí)間呈正相關(guān)，并能明顯抑制CC細(xì)胞體外侵襲的能力[8]。對(duì)高度化療耐藥的CC細(xì)胞，每周使用單劑多西他賽可快速降低HCG水平(超過95%), 且對(duì)人體毒性最小，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多西他賽可靶向P53、AKT1、STAT3、VEGFA等294個(gè)基因，參與細(xì)胞凋亡與增殖的調(diào)控、分子合成與代謝的調(diào)控等主要生物過程。抑癌基因TP53編碼p53腫瘤蛋白，其能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和避免細(xì)胞癌變發(fā)生。任何導(dǎo)致TP53失活的突變都會(huì)引起其抑癌功能的喪失而導(dǎo)致癌癥發(fā)生[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)女性TP53突變攜帶者罹患CC的風(fēng)險(xiǎn)更高，且易產(chǎn)生化療耐藥，因此靶向調(diào)控p53對(duì)于多西他賽治療CC具有重要的臨床價(jià)值。蛋白激酶B1(AKT1)是AKT的一個(gè)亞型，是生存信號(hào)通路PI3K/AKT的關(guān)鍵分子，與腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移以及促進(jìn)血管形成密切相關(guān)。研究[15]發(fā)現(xiàn)，在CC細(xì)胞系中，逆轉(zhuǎn)AKT1表達(dá)可能通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路及靶向負(fù)調(diào)控VEGFA表達(dá)，最終抑制CC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)是一類具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控雙重功能的蛋白質(zhì)家族，激活后與DNA分子結(jié)合發(fā)揮作用[16]。多項(xiàng)研究[17-18]證實(shí)STAT3是參與惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì), IL-6/STAT3通路與CC細(xì)胞增殖密切相關(guān)，阻斷 STAT3信號(hào)通路能夠抑制CC細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)CC細(xì)胞凋亡。

研究[19-20]表明, p53信號(hào)通路與腫瘤發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，其可以激活多條信號(hào)通路，阻礙細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞衰老以及DNA修復(fù)過程，最終抑制腫瘤生長。研究[21]發(fā)現(xiàn)p53和p21CIP1是p53信號(hào)通路中重要的靶基因，在CC JEG-3細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白依懶性激酶抑制劑p21CIPI表達(dá)被激活后，使G2細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK1表達(dá)顯著降低，同時(shí)p53絲氨酸磷酸化水平增加, p53信號(hào)通路激活后使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，進(jìn)而激活DNA損傷反應(yīng)通路，抑制細(xì)胞增殖。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)多西他賽和CC進(jìn)行靶標(biāo)挖掘和通路分析，得到294個(gè)共同靶向基因和CC多條信號(hào)通路，包括TP53、AKT1、STAT3、VEGAF等基因以及細(xì)胞凋亡通路、p53通路等信號(hào)通路，證明了多西他賽可能通過調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因、調(diào)控蛋白表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)通路而發(fā)揮對(duì)CC的治療作用，初步揭示了多西他賽治療CC的作用機(jī)制，為后續(xù)臨床研究提供了新思路。