于曉云，陳 韡，李子海，蔣潔瑤，華云暉，魯 嚴

1南京市中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第二醫(yī)院）皮膚科，江蘇 南京 210003；2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇 南京 210029

梅毒仍然是一個全球性的公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織估計，每年約有1 000萬至1 200萬新感染病例，并且主要發(fā)生在發(fā)展中國家［1-3］。梅毒螺旋體可以在感染后幾天內(nèi)傳播到中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS），并可能導(dǎo)致無癥狀腦膜炎，如果不及時診斷治療，可能會進展為嚴重和不可逆轉(zhuǎn)的癥狀性神經(jīng)梅毒［4-5］。因此，尋找敏感的生物標志物有助于神經(jīng)梅毒的診斷，對于預(yù)防嚴重的后遺癥具有重要意義。

腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中的性病研究實驗室（venereal disease research laboratory，VDRL）實驗已經(jīng)廣泛應(yīng)用于神經(jīng)梅毒的診斷中，然而，CSF-VDRL 的敏感性為30%～70%，并且CSF-VDRL對早期無癥狀神經(jīng)梅毒的診斷不敏感［6］。因此，急需要開發(fā)比CSF-VDRL 更準確、更靈敏的生物標志物。多種細胞因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞中表達。腦脊液中各種細胞因子水平的升高與幾種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病的嚴重程度或進展有關(guān)［7-9］。已有研究表明，腦脊液中細胞因子如趨化因子CXCL13 水平的升高對神經(jīng)梅毒的診斷有一定價值［10］。然而，目前臨床仍缺乏其他可用于神經(jīng)梅毒診斷的可靠標志物。因此，本研究檢測了神經(jīng)梅毒患者腦脊液中的白細胞介素-1 受體拮抗劑（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1ra）、趨化因子I-TAC/CXCL11 和巨噬細胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）的表達，旨在開發(fā)出可用于神經(jīng)梅毒診斷的新型生物標志物。

1 對象和方法

1.1 對象

研究對象來自2018 年4 月—2019 年12 月南京市第二醫(yī)院皮膚性病科就診的患者。神經(jīng)梅毒組納入標準：①實驗室檢查和臨床表現(xiàn)確診為神經(jīng)梅毒；②人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）抗體試驗呈陰性；③無其他神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；④無腫瘤/自身免疫性疾病、過度炎癥等。患者包括11 例無癥狀性神經(jīng)梅毒、9 例腦膜血管神經(jīng)梅毒和9 例腦膜神經(jīng)梅毒（定義為早期患者，共29例），以及15例麻痹性癡呆和6例脊髓癆（定義為晚期患者，共21 例）。梅毒組為非神經(jīng)梅毒的梅毒患者。每組各50 例。本研究已獲得醫(yī)院倫理審查委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 梅毒和神經(jīng)梅毒的診斷

根據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準WS273-2007》梅毒診斷標準對梅毒患者進行診斷，診斷項目包括流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)和實驗室檢查。

根據(jù)2010 年美國疾病控制中心診療指南對神經(jīng)梅毒進行診斷［11］：①CSF-VDRL 陽性的梅毒患者。②CSF-VDRL 陰性而CSF-梅毒螺旋體顆粒凝集實驗（treponema pallidum particle agglutination，TPPA）陽性的梅毒患者，且伴有以下兩項：在沒有其他已知異常原因的情況下，CSF 蛋白濃度＞500 mg/L 和CSF 白細胞（white blood cell，WBC）計數(shù)≥10×106個/L；符合神經(jīng)梅毒的臨床神經(jīng)或精神病學(xué)表現(xiàn)，無其他已知原因引起此類異常。

1.2.2 神經(jīng)梅毒的治療

神經(jīng)梅毒患者均給予常規(guī)對癥治療及全程驅(qū)梅治療，驅(qū)梅治療前口服潑尼松（30 mg/d），每天1～3 次，持續(xù)3 d。然后每4 h 靜脈注射水劑青霉素（400萬U/次），持續(xù)10～14 d。然后肌內(nèi)注射芐星青霉素G（240萬U/次），每周1次，持續(xù)3周；如果患者對青霉素過敏，則每天靜脈滴注頭孢曲松鈉（2 g/d），持續(xù)10～14 d。

1.2.3 細胞因子的檢測

根據(jù)制造商的說明，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（R&D Systems公司，美國）對CSF中的IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α進行檢測。

1.2.4 神經(jīng)功能缺損程度評分

患者治療前后，采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institute of Health stroke scale，NIHSS）評估患者的神經(jīng)功能［12］。分值范圍為0～45分：輕度（0～15分），中度（16～30分），重度（31～45分）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析，并使用Medcalc 15.2 軟件進行受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析。計數(shù)資料以例數(shù)表示，組間比較采用卡方檢驗。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗。不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，采用Mann-WhitneyU檢驗。IL-1ra、I-TAC/CXCL11 和MIP-1α之間的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析。通過配對t檢驗分析治療前后的差異。通過ROC 曲線評估3 種生物標志物診斷神經(jīng)梅毒的價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 梅毒患者和神經(jīng)梅毒患者的基線數(shù)據(jù)

表1顯示，梅毒患者和神經(jīng)梅毒患者的性別、年齡無顯著差異（P＞0.05）。與梅毒患者相比，神經(jīng)梅毒患者的1/血清快速血漿反應(yīng)素試驗（rapid plasma reagin，RPR）滴度、CSF 蛋白和CSF-WBC 水平均升高（P＜0.05）。

表1 梅毒患者和神經(jīng)梅毒患者的基線數(shù)據(jù)Table 1 Baseline data of syphilis patients and neurosyphilis patients

2.2 神經(jīng)梅毒患者的腦脊液IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α水平升高并且與疾病分期有關(guān)

圖1 顯示，與梅毒患者相比，神經(jīng)梅毒患者的腦脊液IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α水平均升高（P＜0.001）。

圖1 梅毒患者和神經(jīng)梅毒患者的腦脊液IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α水平Figure 1 Cerebrospinal fluid IL-1ra，I-TAC/CXCL11 and MIP-1α levels in patients with syphilis and neurosyphilis

此外，圖2 顯示，與早期神經(jīng)梅毒患者相比，晚期神經(jīng)梅毒患者的腦脊液IL-1ra 水平升高（P＜0.01）。但早期和晚期患者的腦脊液I-TAC/CXCL11和MIP-1α水平無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 早期和晚期神經(jīng)梅毒患者的腦脊液IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α水平Figure 2 Cerebrospinal fluid IL-1ra，I-TAC/CXCL11 and MIP-1α levels in patients with early and late neurosyphilis

2.3 神經(jīng)梅毒患者的腦脊液IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α水平與臨床指標的相關(guān)性

表2 顯示，神經(jīng)梅毒患者腦脊液IL-1ra 水平與1/血清RPR 滴度、CSF蛋白和CSF-WBC 均顯著正相關(guān)（P＜0.05）。腦脊液I-TAC/CXCL11 和MIP-1α水平與1/血清RPR 滴度和CSF 蛋白顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

表2 腦脊液IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α水平與臨床指標的相關(guān)性Table 2 Correlation between cerebrospinal fluid IL-1ra，I-TAC/CXCL11 and MIP-1α levels and clinical indicators

2.4 神經(jīng)梅毒患者治療后的腦脊液IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α水平降低

本研究統(tǒng)計了患者治療前后的NIHSS 評分，結(jié)果顯示，與治療前相比，治療后的NIHSS 評分顯著降低［15.5（5.3～26.5）分vs.5.0（1.0～9.0）分，Z=-3.677分，P＜0.001］。圖3結(jié)果顯示，與治療前相比，患者治療后的腦脊液IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α水平均降低（P＜0.001）。

圖3 神經(jīng)梅毒患者治療前后的腦脊液IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α水平Figure 3 Cerebrospinal fluid IL-1ra，I-TAC/CXCL11 and MIP-1α levels before and after treatment in patients with neurosyphilis

2.5 腦脊液IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α對神經(jīng)梅毒的診斷價值

ROC 曲線分析顯示（圖4、表3），腦脊液IL-1ra、I-TAC/CXCL11 和MIP-1α聯(lián)合診斷神經(jīng)梅毒的曲線下面積（area under curve，AUC）、敏感度和特異度依次為0.91、94.0%和88.0%。聯(lián)合診斷的AUC 和敏感度高于單獨診斷。

表3 腦脊液IL-1ra、I-TAC/CXCL11 和MIP-1α診斷神經(jīng)梅毒的AUC、敏感度和特異度Table 3 Cerebrospinal fluid IL-1ra，I-TAC/CXCL11 and MIP-1α AUC，sensitivity and specificity in the diagnosis of neurosyphilis

圖4 ROC曲線分析腦脊液IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α對神經(jīng)梅毒的診斷價值Figure 4 ROCcurveanalysisofthediagnosticvalueofcerebrospinalfluidIL-1ra，I-TAC/CXCL11andMIP-1αonneurosyphilis

3 討論

梅毒螺旋體能夠在未經(jīng)治療的人體宿主中存活幾十年，最終對多個器官造成損害。梅毒螺旋體可以在感染幾天內(nèi)傳播到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，隨后會導(dǎo)致神經(jīng)梅毒的發(fā)生。神經(jīng)梅毒的臨床和實驗室診斷比較困難，因為與神經(jīng)梅毒感染相關(guān)的抗原具有很高的變異性，其潛在的發(fā)病機制也知之甚少。神經(jīng)梅毒患者如果未及時得到診斷和治療，會導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害和不良后果。當患者具有典型的癥狀和體征時，神經(jīng)梅毒的診斷并不困難。然而，當患者為無癥狀神經(jīng)梅毒時則較難診斷。目前，神經(jīng)梅毒的診斷方法主要是CSF-VDRL實驗［13］。然而，CSF-VDRL實驗的敏感性中等，執(zhí)行起來既繁瑣又耗時。因此，對于VDRL陰性的患者，必須依靠其他實驗室結(jié)果才能做出診斷。

目前，細胞因子在調(diào)節(jié)炎癥和宿主對中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染反應(yīng)中的作用引起了人們的注意［14］。細胞因子是一組重要的炎癥介質(zhì)，它們相互作用［15］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，細胞因子由小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和大腦固有的神經(jīng)元合成［16］。許多研究試圖尋找腦脊液中與神經(jīng)系統(tǒng)疾病進展相關(guān)的細胞因子，從而為揭示導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙的機制提供線索。目前，已經(jīng)有學(xué)者報道了神經(jīng)梅毒患者的血清或腦脊液中的某些細胞因子出現(xiàn)異常，并可用于神經(jīng)梅毒的早期診斷。研究表明，IL-17和干擾素-γ（IFN-γ）參與了與神經(jīng)梅毒相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和炎癥反應(yīng)［17-18］。腦脊液中CXCL13 和CXCL12水平的升高可能對HIV 感染患者神經(jīng)梅毒的診斷具有參考價值［19］。CXCL13對無癥狀神經(jīng)梅毒的診斷具有良好的診斷準確性［10，20］。然而，可用于診斷神經(jīng)梅毒的標志物仍然較少，且診斷效能也并不理想。

現(xiàn)有文獻報道IL-1ra調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥和興奮性毒性，并且在萊姆病患者腦脊液中明顯升高；I-TAC/CXCL11 調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的免疫發(fā)病機制，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒復(fù)制、神經(jīng)毒性和細胞死亡有關(guān)；MIP-1α與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，并且調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥和認知功能。然而，這3種細胞/趨化因子在神經(jīng)梅毒中的報道較少，且尚無文獻報道這3 種因子聯(lián)合用于神經(jīng)梅毒診斷的價值。本研究在預(yù)實驗中已經(jīng)檢測到這3 種因子在神經(jīng)梅毒中異常表達，因此選擇了這3種報道較少的因子開展后續(xù)研究。

IL-1 是一種重要的促炎細胞因子，多項研究均證實神經(jīng)病變的患者和動物腦內(nèi)IL-1 水平升高。IL-1ra 是IL-1 受體拮抗劑，據(jù)報道，外源性應(yīng)用IL-1ra可對神經(jīng)元發(fā)揮保護作用，其作用機制與抗炎和抑制興奮性毒性有關(guān)［21］。IL-1ra基因敲除后可升高小鼠的色氨酸、5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA）和多巴胺代謝產(chǎn)物高香草酸（HVA）水平，IL-1ra 影響動物的焦慮行為［22］。另外，IL-1ra 水平在萊姆病患者腦脊液中明顯升高，并且可反映患者的治療反應(yīng)［23］。

I-TAC/CXCL11 是在感染或炎癥過程中受到IFN-g 刺激后合成的CXC 趨化因子11。I-TAC/CXCL11結(jié)合趨化因子受體CXCR3。I-TAC/CXCL11可將抗原特異性活化的CXCR3 陽性T 細胞募集到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，從而能夠有效控制病毒復(fù)制。然而，持續(xù)表達I-TAC/CXCL11 會導(dǎo)致炎癥細胞持續(xù)浸潤，繼而導(dǎo)致神經(jīng)毒性和細胞死亡。多項研究報道了CXCL11的表達以及對中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的免疫發(fā)病機制的作用［24-26］。

MIP-1α/CCL3 是一種嗜中性粒細胞趨化因子。該趨化因子已在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達，據(jù)報道其同源受體CCR1和CCR5由星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元表達［27］。MIP-1α與神經(jīng)退行性疾病如顳葉癲癇［28］、阿爾茨海默?。ˋD）［29］等有關(guān)。還有研究報道，對小鼠注射MIP-1α可損害小鼠的空間記憶能力，影響突觸可塑性［30］。

基于上述文獻研究結(jié)果，筆者推測IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α可能在神經(jīng)梅毒患者中發(fā)生異常表達，因此開展了這項研究。本研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)梅毒患者的腦脊液IL-1ra、I-TAC/CXCL11 和MIP-1α水平明顯高于非神經(jīng)梅毒患者，并且這3 種因子的水平與1/血清RPR滴度和CSF蛋白均顯著正相關(guān)?；颊呓?jīng)對癥治療后，神經(jīng)功能缺損程度明顯降低，并且腦脊液中IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α的水平也隨之降低。對于IL-1ra而言，由于梅毒螺旋體侵入神經(jīng)系統(tǒng)可引起腦內(nèi)炎癥，而IL-1ra是由所有誘導(dǎo)IL-1合成和釋放的信號以及IL-1本身誘導(dǎo)的，并且IL-1ra對其他促炎細胞因子（如IL-6、TNF-α）的調(diào)控是以可溶性誘騙受體的形式出現(xiàn)，IL-1ra 的表達在IL-1 表達激活后有一定延遲［31］，這表明IL-1ra的主要作用是抑制炎癥反應(yīng)，而不是緩和已經(jīng)進行的炎癥反應(yīng)。因此，IL-1 和IL-1ra 之間的平衡根據(jù)炎癥反應(yīng)的不同而發(fā)生傾斜，IL-1ra 水平的異常升高可能反映梅毒患者腦內(nèi)的炎癥水平及疾病嚴重程度。

對于CXCL11 而言，根據(jù)免疫過程的性質(zhì)和感染因子的不同，許多細胞因子可能調(diào)節(jié)CXCL11 基因的表達，其中，IFN-γ的研究最廣［32］。CXCL11 的受體CXCR3同樣受IFN-γ調(diào)控［33］。據(jù)報道，CXCL11在實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要由星形膠質(zhì)細胞表達［34］。體外趨化實驗證實CXCL11 能促進活化的T 細胞和NK 細胞的趨化［35］。各種疾病模型的實驗研究表明，CXCR3 或其配體的缺失顯著損害了細胞免疫［36］。因此，神經(jīng)梅毒患者腦脊液中CXCL11的升高同樣反映了神經(jīng)系統(tǒng)炎癥損傷加重及細胞免疫失衡。對于MIP-1α而言，MIP-1α主要通過與CCRl和CCR5結(jié)合調(diào)節(jié)巨噬細胞功能，進而調(diào)節(jié)神經(jīng)炎性［37］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生感染后，多種細胞分泌MIP-1α，進而MIP-1α趨化單核/巨噬細胞等到達炎癥部位［38］。Liu等［39］研究表明，使用CCR2和CCR5拮抗劑可提高感染乙腦病毒的小鼠模型的存活率并抑制炎癥，由于CCR5是MIP-1α的受體之一，因此間接說明MIP-1α的含量高低可能與病毒感染及炎癥程度相關(guān)。而本研究中神經(jīng)梅毒患者腦脊液MIP-1α的升高也可能反映梅毒螺旋體侵入了神經(jīng)系統(tǒng)并引起了劇烈的免疫反應(yīng)。

由于成功治療后患者的CSF VDRL可能會持續(xù)數(shù)年，而抗生素治療后CSF IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α的水平迅速下降可能適于監(jiān)測治療反應(yīng)，并將活動性感染與過去的感染區(qū)分開。上述結(jié)果說明IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α均參與神經(jīng)梅毒的發(fā)生機制，并且可反映患者的治療反應(yīng)。為了進一步揭示這3種指標對神經(jīng)梅毒的診斷價值。本研究進行了ROC 曲線分析，結(jié)果顯示3項指標單獨診斷神經(jīng)梅毒的敏感度和特異度均高于80%。此外，3項指標聯(lián)合診斷神經(jīng)梅毒的AUC和敏感度高于單獨診斷。上述結(jié)果充分說明了IL-1ra、I-TAC/CXCL11 和MIP-1α在神經(jīng)梅毒發(fā)生過程中的重要作用。

本研究存在一些局限性。首先，這些生物標志物在其他炎性疾?。ㄈ鐐魅静『湍承┳陨砻庖咝约膊。┲幸灿兴?。然而，不同疾病有不同的診斷手段，根據(jù)患者的病史、血清學(xué)檢查和MRI 檢查等結(jié)果可將其他疾病與神經(jīng)梅毒區(qū)分開。其次，由于這些生物標志物的水平在抗生素治療后可能會急劇下降，因此必須根據(jù)患者，特別是可能存在無癥狀神經(jīng)梅毒的患者的用藥歷史，仔細分析結(jié)果。最后，在合并感染艾滋病毒和梅毒的患者中，腦脊液中IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α的存在可能與梅毒、HIV或兩者都有關(guān)系。因此，這3種生物標志物的診斷效能仍需進一步確定。

總之，本研究的數(shù)據(jù)表明IL-1ra、I-TAC/CXCL11和MIP-1α是診斷神經(jīng)梅毒的潛在生物標志物，可用作神經(jīng)梅毒的輔助診斷工具，并且可用于監(jiān)測神經(jīng)梅毒的治療效果。