馬菁菁，陶桂香，陳 倩*

1南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院兒科研究所，江蘇 南京 210029；2南京醫(yī)科大學兒科學院，江蘇 南京 210029

［關鍵字］兒童；呼吸道病原體；多重PCR；毛細管電泳

急性呼吸道感染（acute respiratory infections，ARI）是兒科最常見的呼吸系統(tǒng)疾病，ARI 的發(fā)病率占兒童呼吸系統(tǒng)疾病首位［1-3］，據(jù)統(tǒng)計，5歲以下兒童每年發(fā)生的600 萬例死亡中有100 萬例是由ARI 引起的［4-5］，給兒童的生長發(fā)育和身體健康帶來了較大危害。許多病毒和細菌都能引起ARI，并且由于患者可能攜帶不止一種病原體，不同病毒之間以及病毒和細菌之間的臨床體征相互重疊，往往使得僅基于臨床表現(xiàn)的病因診斷變得困難，無法確定致病原因，導致抗生素治療無效，造成抗生素濫用以及醫(yī)源性交叉感染［6-7］，因此需要對呼吸道病原體進行快速檢測，從而幫助診斷和準確用藥。

目前國內(nèi)外對呼吸道病原體檢測的方法較多，主要包括傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法、免疫學檢測方法以及新興的分子生物學檢測方法［8-10］。病毒的分離培養(yǎng)及鑒定周期較長；免疫學方法在窗口期通常不能反映現(xiàn)癥感染；單病原體的PCR 方法檢測通量較低。隨著病原體分子診斷技術的不斷提高，多重核酸擴增檢測，已經(jīng)被逐漸運用在臨床檢驗過程中，它是一種速度快、靈敏性高、特異性強的檢測方法，可以顯著減少檢測操作時間和成本，并且能夠快速得到結果［11］。此外，多重核酸擴增檢測能夠提供多目標產(chǎn)物的共擴增，從而能夠?qū)粑兰膊』旌细腥镜念A后和復發(fā)提供重要信息。但是，目前通常使用的多重PCR檢測試劑盒檢測病原體的種類有限：Zhang 等［12］的研究只能檢測大腸桿菌的各種亞型，不能檢測多種病原體；劉曉萌等［13］對肺炎常見病原菌的多重PCR 檢測，僅能檢測肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌3 種病原體。這一現(xiàn)狀導致在快速鑒別病原體方面存在較大困難，不能及時指導臨床治療。

本研究以兒童常見呼吸道病原體：肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.au）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.Ae）、陰溝桿菌（Enterobacter cloacae，Ecl）、白色假絲酵母菌（Candida albicans，Cal）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，Aba）作為診斷目標，建立多重PCR 結合毛細管電泳法檢測體系，以提高兒童呼吸道感染診斷的效率。

1 材料和方法

1.1 材料

引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，磁珠法病毒總核酸提取試劑盒（西安天隆科技有限公司），毛細管電泳儀（Bioptic，江蘇光鼎生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 對象

隨機收集南京市兒童醫(yī)院2020年11—12月266例兒童呼吸道病原體臨床檢測剩余樣本。

1.2.2 痰液處理及核酸提取

本研究創(chuàng)造性使用了一種高效核酸釋放劑，使得細菌的細胞壁以及病毒的核衣殼充分破裂，核酸更加充分地釋放出來。同時釋放的核酸尤其是一些病毒的核酸是RNA，RNA 非常不穩(wěn)定，通過加入RNA 酶抑制劑和RNA 保護劑等，最大程度防止RNA 的降解；又針對細菌核酸提取，在裂解液中加chelex-100 提高核酸純度。通過以上方式的優(yōu)化，在痰液樣本被充分液化的基礎上，樣本中的細菌或病毒被充分純化，同時將后續(xù)核酸的提取時間從傳統(tǒng)的柱膜法或磁珠法的30～60 min縮短到僅需約8 min，核酸釋放量也是傳統(tǒng)方法的兩倍左右。

1.2.3 引物設計、PCR擴增體系及條件建立

我們利用相同的嵌合引物來設計特異引物，首先確定基本的PCR 反應體系，進行單重PCR，篩選出最佳基因特異性引物濃度。按照上述引物濃度以及PCR促進劑濃度［四甲基氯化銨（TMAC）、甜菜堿、BSA、四甲基亞砜（TMSO）、海藻糖等］，進行了多重擴增體系的摸索，最終建立起一個7重擴增體系，分別包括肺炎支原體、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、陰溝桿菌、白色假絲酵母菌、鮑曼不動桿菌。其引物設計如表1所示。擴增體系為50 μL：ddH2O 34.5 μL，10×Taq buffer 5 μL，dNTP Mix1μL，Primer Pool 4.0 μL，模 板5 μL，Taq 酶0.5 μL。單重PCR擴增條件方案：95 ℃5 min；95 ℃15 s、55～60 ℃40 s、72 ℃30 s（10個循環(huán)）；95 ℃15 s、55～60 ℃30 s、72 ℃30 s（20 個循環(huán)）；72 ℃5 min。多重PCR 擴增條件方案：95 ℃5 min；95 ℃15 s、58 ℃40 s、72 ℃30 s（10 個循環(huán)）；95 ℃15 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s（20個循環(huán)）；72 ℃5 min。

表1 本文所使用引物

1.2.4 毛細管電泳檢測

取1 μL 擴增后核酸樣本，使用毛細管電泳儀對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測。

1.2.5 臨床樣本檢測

采用上述建立方法檢測266例臨床檢測剩余樣本。

2 結果

2.1 7 種呼吸道病原體單重PCR 產(chǎn)物毛細管電泳檢測分析

對7 種呼吸道病原體：MP、S.au、KP、P.Ae、Ecl、Cal、Aba 分別進行單重PCR 擴增，產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳后均檢測到相應片段，無明顯的感染雜峰出現(xiàn)，引物設計合理（圖1）。

圖1 7種呼吸道病原體單重PCR結合毛細管電泳檢測結果

2.2 7 種呼吸道病原體多重PCR 擴增結合毛細管電泳檢測分析

對7 種呼吸道病原體逐步進行多重PCR 擴增，調(diào)整擴增程序以及引物濃度，至無非特異性擴增條帶，最終建立一個7種呼吸道病原體多重PCR擴增結合毛細管電泳的檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳，均檢測到對應片段，無明顯雜峰出現(xiàn)（圖2）。

圖2 7種呼吸道病原體多重PCR結合毛細管電泳檢測結果

2.3 臨床樣本檢測結果

對266例兒童呼吸道病原體痰液樣本，進行7重PCR擴增并結合毛細管電泳分析，結果顯示37例陽性，其中：8例肺炎支原體陽性（陽性率為3.0%），2例白色假絲酵母陽性（陽性率為0.8%），10 例金黃色葡萄球菌陽性（陽性率為3.8%），8 例肺炎克雷伯菌陽性（陽性率為3.0%），2例銅綠假單胞菌陽性（陽性率為0.8%），1 例陰溝桿菌復合群陽性（陽性率為0.4%），3例鮑曼不動桿菌陽性（陽性率為1.1%）。該檢測結果同痰培養(yǎng)以及實時熒光定量PCR（因肺炎支原體較難培養(yǎng)，故與實時熒光定量PCR結果作對比）比較，敏感性提高，多檢測3例（表2）。

表2 兩種檢測方法陽性對比 （n）

2.4 多重PCR 與單重PCR 結合毛細管電泳檢測的比較

在266 例兒童呼吸道病原體痰液標本中，隨機選擇100 例，分別進行7 種病原體的單重PCR 擴增并結合毛細管電泳和多重PCR 結合毛細管電泳檢測分析，結果一致（表3）。

表3 多重PCR結合毛細管電泳與單重PCR結合毛細管電泳檢測方法對比 （n）

3 討論

引起兒童ARI 的病原體種類較多，涉及多種病毒和細菌，且臨床癥狀表現(xiàn)相似，因此臨床醫(yī)生很難根據(jù)臨床癥狀做出準確的病因診斷，如何快速準確地檢測出患者所感染的呼吸道病原體一直是臨床診斷面臨的難點［14］。本研究建立了7種呼吸道病原體PCR擴增結合毛細管電泳分析的技術。

這種檢測方法可以一次性檢測并區(qū)分多種呼吸道感染的病原體。本研究選取各種呼吸道感染病原體的保守序列進行PCR分析，在設計引物的同時注意不同病原體產(chǎn)物長度的差異化，以便于毛細管電泳的直觀判斷分析。陽性參考品經(jīng)毛細管電泳檢測，條帶長度與設計長度基本一致，未出現(xiàn)明顯非特異性檢測峰；利用此方法檢測了2020年11—12 月隨機收集的266 例兒童呼吸道病原體痰液樣本，各病原體的檢出率高于痰培養(yǎng)及實時熒光定量PCR，且檢測時間遠遠短于細菌培養(yǎng)，能夠滿足臨床實驗室診斷的需求。除此之外，本研究在266 例上述標本中，隨機選取100例標本，進行7種病原體單重PCR結合毛細管電泳檢測，該結果與多重PCR結果完全一致，進一步佐證了多重PCR結合毛細管電泳檢測技術的可靠性。

多重PCR結合毛細管電泳檢測，在發(fā)揮毛細管電泳檢測技術優(yōu)勢的前提下，最大程度降低檢測成本，提高檢測效率［15］，未來該技術值得在臨床大范圍推廣和應用。