劉立明，張國慶，李春花，王海洋，趙立峰，陳芯羽，王天文，張和平，李昌，趙翠青*

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132101；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春獸醫(yī)研究所/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院人獸共患病毒病防控關(guān)鍵技術(shù)研究創(chuàng)新單元，吉林 長春 130122)

蛋雞在產(chǎn)蛋后期，腸道代謝性損傷導(dǎo)致營養(yǎng)素吸收下降、機(jī)體代謝疾病加劇(脂肪肝、骨質(zhì)疏松癥等)以及雞蛋(蛋殼、蛋清)品質(zhì)嚴(yán)重下降，極大影響了養(yǎng)殖效益。因此，如何緩解或有效解決產(chǎn)蛋后期生產(chǎn)性能和產(chǎn)品品質(zhì)下降，對于提升蛋雞養(yǎng)殖效益及蛋雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展和升級具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。蛋雞養(yǎng)殖業(yè)上利用生物資源來達(dá)到這一目的做法越來越具有實(shí)踐應(yīng)用意義，并且具有廣闊的應(yīng)用前景和很大的開發(fā)價(jià)值。

益生菌因其綠色無公害、無藥物殘留等優(yōu)點(diǎn)已成為近年來業(yè)界關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。目前我國允許飼料添加劑使用的微生物有30種，益生菌在實(shí)際生產(chǎn)中得到了較廣泛的應(yīng)用。國內(nèi)外均有報(bào)道指出，在蛋雞產(chǎn)蛋期間添加益生菌可以提高蛋雞采食量[1]、改善飼料利用率[2]、提高雞蛋的蛋品質(zhì)，降低雞蛋內(nèi)膽固醇含量[3- 4]，另外益生菌可以減少雞氨氣的排放，降低腸道內(nèi)有害菌的含量[5]，降低病原微生物的感染和提高機(jī)體免疫功能等[6]。

本試驗(yàn)旨在探討植物乳桿菌LPJZ-658對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)和血清生化指標(biāo)方面的影響，初步探討產(chǎn)蛋后期飼喂LPJZ-658的有效性，為其在產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種和試劑藥品

植物乳桿菌LPJZ-658為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。MRS培養(yǎng)基購自北京索萊寶公司，Pierce BCA Protein Assay Kit購自Thermo Fisher Scientific公司，試驗(yàn)所用甘油三酯(TG)檢測試劑盒、游離脂肪酸檢(NEFA)測試劑盒、低密度脂蛋白(LDL)檢測試劑盒、甘油(Gly)檢測試劑盒、孕酮(PROG)檢測試劑盒、碳酸酐酶(CA)檢測試劑盒、降鈣素(CT)檢測試劑盒、雌二醇(E2)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)動物及分組

選取健康、產(chǎn)蛋均勻的443日齡京紅1號產(chǎn)蛋雞，飼養(yǎng)過程中不添加抗生素，分為對照組、試驗(yàn)組，每組30只，每個(gè)組內(nèi)設(shè)5個(gè)重復(fù)組，每個(gè)重復(fù)組6只雞，采用3層全階梯籠養(yǎng)，每籠2只，試驗(yàn)期45 d。試驗(yàn)過程中，蛋雞每天早、晚(早晨60 g/只，晚上50 g/只)各飼喂一次日糧。每天早晨在每千克日糧中，對照組添加5.6 mL的MRS液體培養(yǎng)基，試驗(yàn)組添加5.6 mL、3×1010CFU/mL的LPJZ-658益生菌，混合均勻后平均添加至各籠蛋雞飼料槽中?；A(chǔ)日糧原料配制參照我國《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T33—2004)[7]中產(chǎn)蛋雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，日糧成分和營養(yǎng)水平如表1所示。

表1 基礎(chǔ)日糧原料配比與營養(yǎng)成分

1.3 生產(chǎn)性能測定

試驗(yàn)期共分為3個(gè)階段，前期(1～15 d)、中期(16～30 d)、后期(31～45 d)。每天收取蛋、稱量蛋重、記錄每組蛋雞的剩余飼料量、產(chǎn)蛋數(shù)、雞蛋重量。計(jì)算料蛋比、產(chǎn)蛋率。

料蛋比=采食量/總蛋重，

產(chǎn)蛋率=(產(chǎn)蛋數(shù)/蛋雞數(shù))×100%。

1.4 雞蛋品質(zhì)測定

試驗(yàn)周期結(jié)束后，在第45天每組隨機(jī)抽取20枚雞蛋，檢測蛋品質(zhì)。記錄蛋重?cái)?shù)據(jù)；并通過雞蛋的縱徑與橫徑之比測定蛋形指數(shù)；使用蛋殼強(qiáng)度測定儀(日本FHK公司)，測定蛋殼強(qiáng)度；分別取蛋殼的銳端、中部、鈍端，使用蛋殼厚度測定儀(日本FHK公司)，測定蛋殼厚度的均值。完好的蛋黃和蛋白打到玻璃板上，使用游標(biāo)卡尺測定蛋黃直徑，使用蛋黃比色扇記錄蛋黃顏色，取三處蛋白的平均值計(jì)算蛋白高度。通過測得的蛋白高度(H)和蛋重(W)計(jì)算哈氏單位。

哈氏單位=100×lg(H-1.7W0.37+7.57)。

1.5 蛋殼超微結(jié)構(gòu)觀察

每組隨機(jī)取5個(gè)蛋，去除蛋清蛋黃。每個(gè)雞蛋分別從銳端、赤道、鈍端切下一塊蛋殼樣品(約1 cm2/塊)，用鑷子從邊緣向內(nèi)剝離殼的膜。然后，將蛋殼樣品在2%氫氧化鈉溶液中煮沸10 min，以溶解蛋殼中所有蛋白質(zhì)。最后，將蛋殼樣品烘干，在室溫下保存。所有的蛋殼樣品都安裝在鋁片的上面，用離子涂膜器涂上金粉末，這些樣品在掃描電鏡下進(jìn)行檢查。

1.6 血清生化指標(biāo)測定

將兩組蛋雞新鮮血液，在室溫下靜置2 h，以2 500 r/min的轉(zhuǎn)速，在4 ℃離心30 min，收集血清，參照南京建成試劑盒操作說明，測定血清中甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、游離脂肪酸(NEFA)和甘油(Gly)的含量，以及孕酮(PROG)、碳酸酐酶(CA)、雌二醇(E2)和降鈣素(CT)的含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 2010整理，采用GraphPad Prism 7.00數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件，用t-test對兩組組均值進(jìn)行比較，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，其中*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，***表示差異極顯著(P<0.001)。

2 結(jié)果

2.1 日糧中添加LPJZ-658對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響

與對照組相比，試驗(yàn)前期LPJZ-658試驗(yàn)組料蛋比下降2.01%，平均產(chǎn)蛋率升高5.05%，平均蛋重下降1.08%；試驗(yàn)中期LPJZ-658試驗(yàn)組料蛋比下降3.21%，平均產(chǎn)蛋率升高7.50%，平均蛋重下降2.3%，但是均無顯著變化。如圖1所示，在試驗(yàn)后期，LPJZ-658試驗(yàn)組較對照組料蛋比顯著下降4.42%(P<0.001)，平均產(chǎn)蛋率顯著上升10.28%(P<0.001)，平均蛋重下降1.16%但無顯著變化(P>0.05)。整個(gè)試驗(yàn)周期中，產(chǎn)蛋總數(shù)試驗(yàn)組比對照組升高9.72%。

A. 兩組料蛋比變化; B.兩組產(chǎn)蛋率變化; C.兩組平均蛋重變化; D.兩組產(chǎn)蛋總數(shù)；MRS為對照組，LPJZ-658為試驗(yàn)組；*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，***表示差異極顯著(P<0.001)。下同圖1 LPJZ-658對生產(chǎn)性能指標(biāo)的影響

2.2 日糧中添加LPJZ-658對產(chǎn)蛋后期雞蛋品質(zhì)的影響

試驗(yàn)結(jié)束，收集各組雞蛋檢測雞蛋品質(zhì)，如表2所示，與MRS對照組相比，LPJZ-658試驗(yàn)組雞蛋的蛋殼厚度增大13.16%(P<0.001)、蛋殼強(qiáng)度升高20.32%(P<0.01)、蛋白高度升高32.95%(P<0.001)以及哈氏單位升高16.95%(P<0.001)，但是蛋形指數(shù)、蛋黃直徑和蛋黃顏色均無顯著變化。

表2 LPJZ-658對雞蛋品質(zhì)指標(biāo)的影響

2.3 日糧中添加LPJZ-658對雞蛋蛋殼超微結(jié)構(gòu)的影響

蛋殼超微結(jié)構(gòu)變化對蛋殼質(zhì)量有著重要的影響,因此本研究利用電鏡觀察各組雞蛋的蛋殼超微結(jié)構(gòu)，觀察結(jié)果如圖2所示。LPJZ-658試驗(yàn)組雞蛋的蛋殼有效層(effective layer，EL)顯著增長，乳突層(mastoid layer,ML)顯著縮短，乳突結(jié)節(jié)(mastoid knot,MK)寬度增加不顯著。另外，通過對蛋殼斷面進(jìn)行能譜分析發(fā)現(xiàn)，LPJZ-658試驗(yàn)組蛋殼中鈣的含量比對照組顯著增多(圖3)。

A. MRS對照組蛋殼橫切面;B.LPJZ-658試驗(yàn)組蛋殼橫切面; C. 蛋殼橫斷面超微結(jié)構(gòu)長度計(jì)算；EL為有效層;ML為乳突層;MK為乳突結(jié)節(jié)圖2 LPJZ-658對蛋殼超微結(jié)構(gòu)的影響

A. MRS對照組; B. LPJZ-658試驗(yàn)組圖3 LPJZ-658試驗(yàn)組與對照組蛋殼礦物含量能譜

2.4 日糧中添加LPJZ-658對產(chǎn)蛋后期蛋雞血清生化指標(biāo)的影響

蛋雞經(jīng)歷持續(xù)高產(chǎn)的高峰期后，機(jī)體會出現(xiàn)一系列的變化，例如脂質(zhì)合成和代謝失衡，以及高產(chǎn)狀態(tài)后的生殖系統(tǒng)疾病，輸卵管炎等。因此本研究檢測了蛋雞血清中脂質(zhì)代謝及相關(guān)激素含量。

由圖4可知，與MRS對照組相比，LPJZ-658試驗(yàn)組蛋雞血清中甘油三酯含量無顯著變化，游離脂肪酸、低密度脂蛋白、甘油含量分別降低44.24%(P<0.001)，47.16%(P<0.01)，41.62%(P<0.01)。

A. 血清中甘油三酯含量; B. 血清中游離脂肪酸含量; C. 血清中低密度脂蛋白含量; D. 血清中甘油含量圖4 LPJZ-658對蛋雞血清中脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響

另外，由圖5可知，LPJZ-658試驗(yàn)組與MRS對照組相比，在蛋雞血清中孕酮含量升高114.01%，差異極顯著(P<0.001),降鈣素含量升高92.58%，差異顯著(P<0.05)，碳酸酐酶和雌二醇的含量均無顯著變化(P>0.05)。

A. 血清中孕酮含量;B. 血清中碳酸酐酶含量;C. 血清中降鈣素含量;D. 血清中雌二醇含量圖5 LPJZ-658對血清中激素含量的影響

3 討論

3.1 日糧中添加LPJZ-658對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響

蛋雞開產(chǎn)后為減少應(yīng)激而減少免疫，但會導(dǎo)致產(chǎn)蛋后期蛋雞免疫功能降低，健康水平受到影響，生產(chǎn)性能逐漸下降。日產(chǎn)蛋率、蛋重、料蛋比和采食量都是衡量經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo)，它們受多重因素影響。益生菌對機(jī)體具有多種有益作用，如可以改善腸道菌群結(jié)構(gòu)；改變腸道微生物代謝活動；有效抑制腸道內(nèi)的致病微生物；提高機(jī)體免疫力等。植物乳桿菌可通過合成各種生長因子，在宿主腸道定植，調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡，提高營養(yǎng)物質(zhì)吸收和機(jī)體生長性能[8]。研究表明，產(chǎn)蛋雞后期添加丁酸梭菌可以降低料蛋比，提高效益[9]。張水晶[10]通過在蛋雞日糧中添加益生菌制劑，顯著提高蛋雞的生產(chǎn)性能，降低料蛋比，延長蛋雞的產(chǎn)蛋周期，改善雞腸道健康。本試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)蛋后期日糧中添加LPJZ-658可以顯著降低料蛋比，提高生產(chǎn)性能。因此日糧中添加LPJZ-658可以改善產(chǎn)蛋后期蛋雞的生理狀態(tài)，提高蛋雞對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，從而提高生產(chǎn)性能。

3.2 日糧中添加LPJZ-658對雞蛋品質(zhì)的影響

雞蛋品質(zhì)的好壞決定雞蛋的貯藏、運(yùn)輸以及消費(fèi)者的喜歡程度。蛋白高度和哈氏單位表示雞蛋的新鮮程度。而蛋殼質(zhì)量影響著雞蛋的破損率及運(yùn)輸。已有研究表明：在產(chǎn)蛋雞飼料中添加益生菌，對蛋雞生產(chǎn)性能、雞蛋品質(zhì)等指標(biāo)均有所改善[11]；在蛋雞飲水中添加植物乳桿菌LP-3，可以提高產(chǎn)蛋率，降低料蛋比和破蛋率[12]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧中添加LPJZ-658可以提高蛋白高度、蛋殼厚度和硬度，說明LPJZ-658能夠調(diào)控蛋雞對營養(yǎng)成分的吸收利用，對蛋品質(zhì)有一定的改善作用。

蛋殼質(zhì)量主要由蛋殼結(jié)構(gòu)屬性和物質(zhì)屬性共同決定，前者包括蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度和蛋殼超微結(jié)構(gòu)等，后者則主要取決于蛋殼有機(jī)和無機(jī)組分及二者之間的相互作用[13]。近來的研究發(fā)現(xiàn)，蛋殼指數(shù)等對蛋殼質(zhì)量無顯著影響[14]，而蛋殼超微結(jié)構(gòu)致密度直接影響蛋殼質(zhì)量[13]。乳突層越小、有效層厚度越大，則蛋殼的耐壓強(qiáng)度越大。并且有研究表明，蛋殼鈣的絕對沉積量影響蛋殼超微結(jié)構(gòu)的形成[15]。本試驗(yàn)表明，日糧中添加LPJZ-658可通過改變蛋殼超微結(jié)構(gòu)，促進(jìn)鈣化，改善蛋殼質(zhì)量。

3.3 日糧中添加LPJZ-658對血清生化指標(biāo)的影響

隨著高度集約化、規(guī)?；男笄蒺B(yǎng)殖，限制了動物的正?；顒樱菀讓?dǎo)致動物脂肪代謝異常并引起一系列動物疾病。已有研究表明，蛋雞體內(nèi)脂肪貯存過多會導(dǎo)致蛋雞生產(chǎn)性能及蛋品質(zhì)下降[16]。因此合理調(diào)控蛋雞體內(nèi)的脂肪代謝，是提高蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的有效途徑。血清中甘油三酯、游離脂肪酸、甘油和低密度脂蛋白是反映機(jī)體脂類代謝水平的重要指標(biāo)。有研究指出益生菌通過調(diào)節(jié)腸道微生物群和膽汁酸譜來調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝[17]，混合益生菌顯著改善蛋雞血清生化指標(biāo)[18]。本研究結(jié)果表明，在產(chǎn)蛋后期日糧中添加LPJZ-658能顯著降低蛋雞血清中脂肪酸、甘油和低密度脂蛋白的含量，通過調(diào)節(jié)蛋雞脂質(zhì)代謝進(jìn)而改善產(chǎn)蛋后期蛋雞的生產(chǎn)性能和雞蛋品質(zhì)。

禽類蛋殼形成主要發(fā)生于輸卵管子宮部，該部位是研究生物鈣化作用機(jī)制的模式生物部位，研究表明激素在蛋殼鈣化過程中有重要作用[19]。降鈣素是調(diào)節(jié)人和動物體內(nèi)鈣、磷代謝的重要激素，其能減少骨鈣轉(zhuǎn)變?yōu)檠}，降低血鈣濃度，因此調(diào)節(jié)蛋雞體內(nèi)的降鈣素水平，也是調(diào)節(jié)蛋雞鈣磷比例及骨鈣平衡的一種重要途徑。孕酮是一種重要的類固醇激素，可直接作用于卵巢誘導(dǎo)排卵。研究表明，蛋雞的產(chǎn)蛋率與血液中孕酮含量呈正比關(guān)系[20]。本研究結(jié)果表明，在產(chǎn)蛋后期日糧中添加LPJZ-658能顯著提高孕酮并降低降鈣素的含量，進(jìn)而提高機(jī)體健康水平，使蛋雞在產(chǎn)蛋后期仍能維持較高的產(chǎn)蛋率，提高養(yǎng)殖效益。

綜上所述，產(chǎn)蛋后期在蛋雞日糧中添加植物乳桿菌LPJZ-658，可以顯著提高蛋雞生產(chǎn)性能，提高雞蛋品質(zhì)，調(diào)節(jié)蛋雞血液脂質(zhì)代謝和激素相關(guān)指標(biāo)。可見，日糧中添加適宜劑量的植物乳桿菌LPJZ-658對改善產(chǎn)蛋后期蛋雞的生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)有一定的促進(jìn)作用。研究結(jié)果為植物乳桿菌LPJZ-658的應(yīng)用提供科學(xué)指導(dǎo)。