鄭細(xì)良 祁占寧 張 亮 方治軍 孫智宏

(1 北京市大興區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，北京市 100026，電子郵箱：zfpvtr@163.com；2 延安大學(xué)咸陽醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西省延安市 712000)

隨著生活節(jié)奏的加快，交通事故頻繁發(fā)生，使得顱腦損傷發(fā)生率呈上升趨勢，顱腦損傷易導(dǎo)致神經(jīng)功能缺失，從而影響患者的認(rèn)知功能，甚至對患者的生命健康產(chǎn)生威脅,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。因此，治療顱腦損傷時進行神經(jīng)功能修復(fù)尤為重要[1]。Wnt信號通路是在各種生物體中廣泛存在的一種保守信號通路，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移以及凋亡等多種過程[2]。顱腦損傷后，損傷部位釋放大量的自由基及炎癥因子，使得腦細(xì)胞進一步壞死，加重病情[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)-130a在顱腦損傷部位高度表達，參與氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)損傷的過程[4]。本研究探討基于Wnt通路下調(diào)miRNA-130a的表達對顱腦損傷模型大鼠神經(jīng)功能的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只SD健康雄性大鼠，購自上海斯萊克公司，許可證號：SYXK(冀)2020-009，月齡7～10 (8.5±0.8)個月，體重220～232 (226.8±3.9)g。在濕度為50%～55%、溫度為(24.1±2.1)℃、充足光照(光照12 h/d)的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1周。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)甘酯鈉注射液(齊魯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20046213)；Wnt3a mRNA、β-聯(lián)蛋白(β-catenin)mRNA提取試劑盒購自大連Takara生物工程有限公司；miRNA-130a試劑盒由武漢華美生物工程公司提供；兔抗小鼠單抗細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)抗體(艾美捷科技有限公司，批號：A-AO1014a)；小鼠抗小鼠白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α抗體(上海臻科生物科技有限公司，批號：48T96T、AB24781)；小鼠抗小鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD) 、丙二醛、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)抗體(武漢博士德生物工程有限公司，批號：AB24156、AB15874、AB57841、AB26348)。

1.3 方法

1.3.1 分組與建模：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠按照隨機數(shù)字表法分為正常組(10只)和干預(yù)組(20只)，正常組不做處理，采用Feeney自由落體硬膜外撞擊法[5]對干預(yù)組大鼠建立顱腦損傷模型。建模方法為，給予大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)麻醉后，將大鼠頭部固定，剪去頭頸皮毛，消毒皮膚，沿中線右側(cè)將頭皮切開，分離骨膜至顱骨，暴露硬腦膜，再以直徑為4.5 mm、重量為25 g的砝碼，造成30 cm高空墜落的打擊力，使大鼠出現(xiàn)顱腦損傷。建模后大鼠表現(xiàn)出瞳孔縮小、肢體抽搐等癥狀，即表示建模成功。本實驗共有19只大鼠建模成功，將建模成功的大鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型組(9只)和下調(diào)miRNA-130a組(10只)。給予下調(diào)miRNA-130a組大鼠經(jīng)尾靜脈注射單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)甘酯鈉注射液30 mg/kg，1次/d，共3天，以進行基于Wnt通路下調(diào)miRNA-130a的干預(yù)[6]，正常組、模型組大鼠每日給予腹腔注射同等劑量的生理鹽水。3組大鼠均連續(xù)注射7 d。

1.3.2 標(biāo)本采集：所有大鼠連續(xù)干預(yù)1周后取心臟血液3 mL，2 000 r/min離心20 min，分離上清液，置于-80℃冰箱保存。腹主動脈采血5 mL后麻醉并斷頭處死大鼠，分離腦組織，取右側(cè)海馬組織于液氮中快速冷凍，置于-80℃冰箱保存。

1.3.3 蘇木精-伊紅染色：取大鼠左側(cè)海馬區(qū)腦組織，4%甲醛固定24 h后行常規(guī)石蠟包埋及連續(xù)切片，將切片烤干后進行脫蠟處理，之后依次置入不同濃度(95%、80%、70%)的酒精中，3 min/次。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，30 s/次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用酒精脫水處理后進行脫蠟處理，封片后在顯微鏡下觀察蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色結(jié)果。

1.3.4 miRNA-130a、Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA相對表達水平的測定：采用實時熒光定量PCR技術(shù)法檢測miRNA-130a，以及Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA的相對表達水平。首先提取海馬細(xì)胞總RNA，檢測其RNA純度及濃度后，進行反轉(zhuǎn)錄處理，獲得cDNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，行PCR擴增,采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物序列，由Invitrogen公司合成引物。引物序列見表1。反應(yīng)條件為96℃ 6 min；94℃ 15 s、65℃ 45 s，60個循環(huán)。以2-△△Ct方法計算miRNA-130a、Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA相對表達水平，實驗重復(fù)3次，取平均值。

表1 引物序列

1.3.5 大鼠血清中的SOD、丙二醛、IL-6、TNF-α、神經(jīng)生長因子、BDNF、NSE、MCP-1水平的檢測：(1)采用分光光度法檢測SOD水平，采用硫代巴比妥酸熒光法測定丙二醛水平。(2)采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測IL-6、TNF-α及神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、BDNF、NSE、MCP-1水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠海馬區(qū)腦組織HE染色結(jié)果 正常組海馬區(qū)腦細(xì)胞排列整齊密集，且細(xì)胞大小、形態(tài)正常，胞核完整；模型組大鼠海馬區(qū)腦細(xì)胞間隙較寬，細(xì)胞腫脹，且神經(jīng)元萎縮及腫脹，出現(xiàn)核固縮；與模型組比較，下調(diào)miRNA-130a組大鼠海馬區(qū)腦組織的病理改變明顯減輕。見圖1。

正常組 模型組 下調(diào)miRNA-130a組

2.2 3組大鼠海馬組織Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA及miRNA-130a相對表達水平的比較 與正常組相比，模型組、下調(diào)miRNA-130a組Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA相對表達水平均升高(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)miRNA-130a組Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA及miRNA-130a相對表達水平均降低(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠海馬組織Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA及miRNA-130a相對表達水平的比較(x±s)

2.3 3組大鼠血清SOD、丙二醛水平的比較 與正常組相比，模型組、下調(diào)miRNA-130a組的SOD水平降低，丙二醛水平升高(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)miRNA-130a組的SOD水平升高，丙二醛水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠血清SOD、丙二醛水平的比較(x±s)

2.4 3組大鼠血清IL-6、TNF-α及MCP-1水平的比較 與正常組相比，模型組、下調(diào)miRNA-130a組的IL-6、TNF-α及MCP-1水平均升高(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)miRNA-130a組的IL-6、TNF-α、MCP-1水平降低(P<0.05)。見表4。

表4 3組大鼠血清IL-6、TNF-α及MCP-1水平的比較(x±s)

2.5 3組大鼠血清NSE、BDNF及NGF 水平的比較 與正常組相比，模型組、下調(diào)miRNA-130a組的NSE水平升高、BDNF及NGF 水平降低(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)miRNA-130a組NSE水平降低，BDNF、NGF水平升高(P<0.05)。見表5。

表5 3組大鼠血清NSE、BDNF及NGF 水平的比較(x±s)

3 討 論

顱腦損傷作為臨床上較為常見的一種創(chuàng)傷，常表現(xiàn)為意識障礙、頭痛以及嘔吐等，給患者的生活帶來嚴(yán)重的影響[5]。研究顯示，顱腦損傷常導(dǎo)致腦組織缺血缺氧、炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡等，使得病情進一步發(fā)展，引發(fā)腦缺血及腦梗死，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[6]。多數(shù)顱腦損傷患者可出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，尤其是由鈍器或銳器外力所致的顱腦損傷患者，常留有不同程度的神經(jīng)功能障礙[7]。探尋有效治療顱腦損傷所致神經(jīng)功能障礙的方法是臨床研究的熱點[8]。

Wnt信號通路是神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化過程中較為關(guān)鍵的調(diào)控通路[9]。正常情況下，Wnt/β-catenin通路表達水平較低，但發(fā)生顱腦損傷時該通路將會被激活。其中Wnt3a為Wnt/β-catenin通路的起始蛋白，其表達升高將會激活Wnt信號通路[10]。β-catenin為Wnt/β-catenin通路中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，正常組織細(xì)胞中β-catenin以磷酸化的降解復(fù)合物形式存在，且含量較低。miRNA在真核細(xì)胞中廣泛存在，參與各種生理、病理過程[11]。miRNA-130a為miRNA-130具有代表性的因子，研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中miRNA-130a均呈高表達，其通過細(xì)胞內(nèi)多個信號通路參與腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲過程[12]。研究顯示，在顱腦損傷中，下調(diào)miRNA-130a相對表達水平，可有效減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，提示下調(diào)miRNA-130a的表達可能對顱腦損傷具有保護作用[14]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)miRNA-130a組海馬區(qū)腦組織病理改變較模型組減輕，且與模型組相比，下調(diào)miRNA-130a組的Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA及miRNA-130a相對表達水平均降低(P<0.05)，說明通過Wnt通路下調(diào)miRNA-130a能夠減輕顱腦損傷模型大鼠的腦組織損傷。

顱腦損傷時氧自由基大量釋放，腦組織中的SOD水平下降，丙二醛水平升高[14]。研究顯示，在顱腦受到損傷后，氧化應(yīng)激將會加重腦損傷過程，導(dǎo)致大量氧自由基的產(chǎn)生，進而促進蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化等，引發(fā)腦水腫、顱內(nèi)壓升高的發(fā)生[15]。SOD、丙二醛水平或活性高低與氧自由基導(dǎo)致的腦損傷具有密切聯(lián)系[16]。例如，血清中SOD水平降低會導(dǎo)致腦細(xì)胞破壞程度增加，對氧自由基的滅活作用減弱，加劇病情進展；丙二醛水平上升會加劇氧自由基的攻擊損害[17]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，下調(diào)miRNA-130a組的SOD水平升高，丙二醛水平降低(P<0.05)，說明通過Wnt通路下調(diào)miRNA-130a的表達水平能夠減輕顱腦損傷大鼠的氧化應(yīng)激水平。

在顱腦損傷患者腦內(nèi)神經(jīng)元受損、變性及凋亡的過程中，均有炎癥反應(yīng)的參與，且炎癥反應(yīng)為多種創(chuàng)傷后共有的病理過程。炎癥反應(yīng)能改變顱腦損傷患者血-腦屏障的通透性，使腦血流紊亂，進而加重患者的缺氧、缺血，使腦組織受損程度增加[18]。IL-6為促炎因子,當(dāng)其水平顯著上升時，血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增大，加重繼發(fā)性腦損傷[19]。TNF-α是活化巨噬細(xì)胞的小分子，當(dāng)其水平過度升高可促進其他炎癥因子釋放，同時會加劇組織細(xì)胞損傷。MCP-1是一種單核細(xì)胞特異性趨化因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，下調(diào)miRNA-130a組的IL-6、TNF-α、MCP-1水平降低(P<0.05)，提示通過Wnt通路下調(diào)miRNA-130a表達水平能夠降低顱腦損傷大鼠炎癥反應(yīng)水平。

顱腦損傷常伴有神經(jīng)損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，影響其生活質(zhì)量[20]。血清中NSE能反映神經(jīng)損傷程度，當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后，其水平將會顯著升高。BDNF與NGF均能夠促進神經(jīng)功能重建。BDNF為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員，由腦組織合成，主要分布在腦皮質(zhì)、紋狀體區(qū)以及海馬區(qū)，在神經(jīng)細(xì)胞軸突生長，神經(jīng)元存活，促進神經(jīng)康復(fù)，抵抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡及增加突觸可塑性中發(fā)揮重要作用[21]。NGF具有促進神經(jīng)突起生長的生物效應(yīng)，參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分化以及損傷修復(fù)等過程[22]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，下調(diào)miRNA-130a組的NSE水平降低，BDNF、NGF水平升高(P<0.05)，說明通過Wnt通路下調(diào)miRNA-130a表達水平能夠減輕顱腦損傷模型大鼠的神經(jīng)損傷程度，促進神經(jīng)功能修復(fù)。

綜上所述，基于Wnt通路下調(diào)miRNA-130a表達水平對顱腦損傷大鼠進行干預(yù)，能夠降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，減輕腦組織損傷，促進神經(jīng)功能修復(fù)。