閆 雷 楊 洋

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬宿州醫(yī)院放化療科，宿州市 234000,電子郵箱：yanlei0702@163.com)

2020年，女性乳腺癌約有226萬新病例，其發(fā)病率已超過肺癌，成為全球發(fā)病率最高的癌癥，占所有新癌癥病例的11.7%，同時其也是全球第五大癌癥死亡原因[1]，這給國家及個人帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還給個人帶來一定的心理壓力。因此，應(yīng)積極改善乳腺癌患者的預(yù)后，以減輕其負(fù)擔(dān)并提高其生活質(zhì)量。由于血管的有限供氧能力和腫瘤細(xì)胞的高耗氧能力之間處于不平衡的狀態(tài)，大多數(shù)實(shí)體惡性腫瘤都存在一定程度的缺氧。缺氧導(dǎo)致腫瘤出現(xiàn)缺氧耐受細(xì)胞，該細(xì)胞能夠促進(jìn)腫瘤的局部侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[2]。故靶向缺氧成為治療癌癥的重要策略之一[3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在不同水平上參與癌癥的發(fā)生和發(fā)展，包括表觀、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[4]。研究表明lncRNA與多種腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[5]。尋找與乳腺癌缺氧相關(guān)的關(guān)鍵lncRNA，對于改善患者的預(yù)后具有重要意義。本研究分析癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(the Cancer Genome Atlas,TCGA)中乳腺癌患者的lncRNA表達(dá)，篩選出具有預(yù)后預(yù)測價值的缺氧相關(guān)lncRNA，并構(gòu)建預(yù)測乳腺癌預(yù)后的風(fēng)險評分模型，旨在為臨床預(yù)測乳腺癌患者的預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與篩選 從TCGA數(shù)據(jù)庫(https：//portal.gdc.ancer.gov/)中獲取乳腺癌患者的RNA轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理診斷為乳腺導(dǎo)管癌或乳腺小葉癌的初治女性患者；(2)患者的lncRNA表達(dá)水平檢測數(shù)據(jù)和年齡、生存時間等臨床數(shù)據(jù)無缺失。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)隨訪時間≤30 d或隨訪時間缺失；(2)男性乳腺癌患者；(3)其余病理類型者。最終獲得981例乳腺癌患者的資料。患者年齡(58.19±13.20)歲，生存時間為31d至23.57年(隨訪起始點(diǎn)不詳)；腫瘤分級Ⅰ級172例，Ⅱ級589例，Ⅲ級202例，Ⅳ級18例；T1期269例，T2期547例，T3期129例，T4期36例；M0期866例，M1期115例；N0期481例，N1期307例，N2期118例，N3期75例。

1.2 缺氧相關(guān)基因共表達(dá)的lncRNA的篩選 應(yīng)用R 4.0.2軟件中的limma軟件包從乳腺癌患者的RNA測序數(shù)據(jù)中提取缺氧相關(guān)基因的表達(dá)信息(缺氧相關(guān)基因從https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫獲得)。應(yīng)用R 4.0.2軟件，采用Spearman檢驗(yàn)評估lncRNA與缺氧相關(guān)基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性，以r2>0.3、P<0.001為標(biāo)準(zhǔn)篩選缺氧相關(guān)基因共表達(dá)的lncRNA。

1.3 與乳腺癌預(yù)后有關(guān)的缺氧相關(guān)lncRNA的篩選及其風(fēng)險評分模型構(gòu)建 應(yīng)用R 4.0.2軟件進(jìn)行LASSO回歸、單因素和多因素Cox回歸分析。首先，以生存情況作為因變量，以獲得的缺氧相關(guān)基因lncRNA作為自變量，采用批量單因素Cox回歸分析篩選與乳腺癌預(yù)后有關(guān)的缺氧相關(guān)lncRNA(以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn))。然后，將獲得的lncRNA納入LASSO回歸，經(jīng)驗(yàn)證，當(dāng)λ值為-4.96時模型擬合較好，將此條件下篩選出的lncRNA作為自變量，進(jìn)行多因素Cox回歸分析。多因素Cox回歸分析時，使用survival包通過PH假設(shè)和共線性檢驗(yàn)自變量，確定與乳腺癌預(yù)后有關(guān)的缺氧相關(guān)lncRNA及其回歸系數(shù)；建立基于缺氧相關(guān)lncRNA預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后的風(fēng)險評分模型，即風(fēng)險評分=lncRNA1回歸系數(shù)×lncRNA1表達(dá)量+lncRNA2回歸系數(shù)×lncRNA2表達(dá)量+......+lncRNAn回歸系數(shù)×lncRNAn表達(dá)量。

1.4 風(fēng)險評分模型預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后的能力的驗(yàn)證 計算每例乳腺癌患者的風(fēng)險評分，根據(jù)中位值將乳腺癌患者分為高危組和低危組，應(yīng)用R 4.0.2軟件繪制兩組的生存曲線(Kaplan-Meier法)，并采用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較(以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)。應(yīng)用R 4.0.2軟件繪制時間依賴性受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線，采用一致性指數(shù)(concordance index,C-index)和曲線下面積(area under the curve,AUC)評估風(fēng)險評分預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后的效能。

1.5 乳腺癌患者預(yù)后的影響因素及Nomogram模型的構(gòu)建 應(yīng)用R 4.0.2軟件，將風(fēng)險評分和年齡及腫瘤分級、原發(fā)腫瘤-區(qū)域淋巴結(jié)-遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(tumor-node-metastasis，TNM)分期等臨床病理特征作為自變量進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，進(jìn)一步分析乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。利用獲得的獨(dú)立影響因素構(gòu)建Nomogram模型，包括預(yù)測乳腺癌患者1年、3年、5年生存情況的風(fēng)險模型；隨后應(yīng)用ROC曲線評價并比較Nomogram模型與年齡及腫瘤分級、TNM分期等臨床病理指標(biāo)預(yù)測乳腺癌患者生存情況的效能。

2 結(jié) 果

2.1 與乳腺癌預(yù)后有關(guān)的缺氧相關(guān)lncRNA及風(fēng)險評分 以r2>0.3、P<0.001為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出1 180個與缺氧相關(guān)的lncRNA。采用單因素Cox回歸分析初步篩選，得到與乳腺癌預(yù)后有關(guān)的缺氧相關(guān)lncRNA共44個(P<0.05)；經(jīng)LASSO回歸分析，發(fā)現(xiàn)其中23個缺氧相關(guān)lncRNA與乳腺癌預(yù)后可能有關(guān)，見圖1。采用多因素Cox回歸進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示有12個缺氧相關(guān)lncRNA與乳腺癌預(yù)后相關(guān)，見表1。其中9個lncRNA(TNFRSF14-AS1、AL606834.2、LINC01871、AL136368.1、SEMA3B-AS1、AL136531.1、BAIAP2-DT、AC061992.1和AC008105.3)是保護(hù)性因素，高表達(dá)患者預(yù)后較好；而3個lncRNA(Z68871.1、LINC01235和AC090198.1)是危險因素，高表達(dá)患者預(yù)后不佳。乳腺癌患者的風(fēng)險評分模型為：風(fēng)險評分=0.563×Z68871.1-0.325×TNFRSF14-AS1-0.370×AL606834.2+0.010×LINC01235-0.368×LINC01871-0.690×AL136368.1-0.062×SEMA3B-AS1-0.439×AL136531.1-0.043×BAIAP2-DT-0.215×AC061992.1+0.091×AC090198.1-0.535×AC008105.3。

圖1 LASSO回歸分析結(jié)果

表1 多因素Cox回歸分析結(jié)果

2.2 風(fēng)險評分的驗(yàn)證結(jié)果 根據(jù)缺氧相關(guān)lncRNA的風(fēng)險評分(中位值為1.27分)，將乳腺癌患者分為低風(fēng)險組(<1.27分，n=491)和高風(fēng)險組(≥1.27分,n=490)，兩組的生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=38.472，P<0.001)，高風(fēng)險組患者的生存時間較短，見圖2。預(yù)后標(biāo)志的C指數(shù)為0.798，表明風(fēng)險評分對乳腺癌具有可靠和準(zhǔn)確的診斷作用。同時時間依賴性ROC曲線分析結(jié)果顯示，基于缺氧相關(guān)lncRNA風(fēng)險評分預(yù)測乳腺癌患者1年、3年和5年生存情況的AUC分別為0.699(95%CI：0.601，0.814；P<0.05)、0.755(95%CI：0.683，0.905；P<0.05)和0.729(95%CI：0.637，0.895；P<0.05)，見圖3。

圖2 低風(fēng)險組和高風(fēng)險組乳腺癌患者的生存曲線比較

圖3 基于缺氧相關(guān)lncRNA的風(fēng)險評分預(yù)測乳腺癌患者生存情況的時間依賴性ROC曲線

2.3 乳腺癌患者預(yù)后的影響因素 以患者年齡(賦值：<60歲=0，≥60歲=1)、腫瘤分級(Ⅰ 期=1，Ⅱ 期=2，Ⅲ期=3，Ⅳ期=4)、T分期(T1期=1，T2期=2，T3期=3，T4期=4)、M分期(M0期=0，M1期=1)、N分期(N0期=0，N1期=1，N2期=2，N3期=3)、風(fēng)險評分(<1.27分=0，≥1.27分=1)作為自變量，以患者生存時間和生存狀態(tài)為因變量，進(jìn)行單因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示年齡、腫瘤分級、T分期、M分期、N分期和風(fēng)險評分均與乳腺癌患者的生存情況相關(guān)(均P<0.05)，見表2。將以上6個指標(biāo)納入多因素Cox回歸模型，結(jié)果顯示年齡和風(fēng)險評分與乳腺癌患者的生存情況相關(guān)(均P<0.05)，見表2。將患者年齡及風(fēng)險評分納入Nomogram模型，構(gòu)建預(yù)測1年、3年、5年生存情況的風(fēng)險模型(見圖4A)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，Nomogram模型預(yù)測乳腺癌患者總體生存情況的AUC值為0.750，略小于年齡(AUC=0.764)，大于腫瘤分級(AUC=0.648)、T分期(AUC=0.669)、M分期(AUC=0.581)和N期(AUC=0.583)，見圖4B。

表2 影響乳腺癌患者生存情況的單因素和多因素Cox回歸分析

圖4 乳腺癌患者Nomogram模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

3 討 論

腫瘤能夠刺激新生血管無序生長，而腫瘤的增殖速度超過血管的生成速度，會導(dǎo)致實(shí)體腫瘤缺氧。持續(xù)低氧導(dǎo)致腫瘤血管的空間扭曲，這可能引起毛細(xì)血管間距增加，從而導(dǎo)致氧擴(kuò)散受到限制；持續(xù)低氧還可能引起閉合的血管重新開放，導(dǎo)致缺氧再灌注損傷、自由基增加、應(yīng)激反應(yīng)基因激活和組織損傷，這也使得藥物難以擴(kuò)散到腫瘤部位[3]。腫瘤細(xì)胞和缺氧性腫瘤微環(huán)境成分之間的相互作用，再加上淋巴管生成和血管生成機(jī)制的激活，使腫瘤對特定臨床干預(yù)措施的反應(yīng)進(jìn)一步復(fù)雜化。因此，需要確定缺氧性腫瘤微環(huán)境，以更好地了解和探討導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制[6]。乳腺癌發(fā)病隱匿，惡性程度較高，有一半以上的患者的病灶存在缺氧區(qū)域，并且與腫瘤侵襲性、化放療反應(yīng)不良直接相關(guān)[7-8]。因此，探討乳腺癌患者腫瘤微環(huán)境中的分子機(jī)制顯得尤為重要。

lncRNA在癌癥的發(fā)展中起著重要作用，已發(fā)現(xiàn)部分lncRNA在乳腺癌中有表達(dá)[9-11]。例如，HOTAIR是目前研究最多的lncRNA調(diào)控因子之一，也是首個作為轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的lncRNA，其表達(dá)上調(diào)時具有致瘤性，可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞系遷移和侵襲，并且HOTAIR上調(diào)的患者存活率往往較低[12]。lncRNA ARNILA在三陰性乳腺癌局部侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[12]。還有研究報告，lncRNA BCRT1在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，且與乳腺癌患者預(yù)后不良有關(guān)；lncRNA BCRT1可以競爭性地與miRNA-1303結(jié)合，阻止其靶基因PTBP3的降解，從而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展；lncRNA BCRT1過表達(dá)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化，這種極化由外切體介導(dǎo)，從而進(jìn)一步加速乳腺癌的進(jìn)展[13]。在本研究中，共獲得12個與乳腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)的缺氧相關(guān)lncRNA，其中TNFRSF14-AS1、AL606834.2、LINC01871、AL136368.1、SEMA3B-AS1、AL136531.1、BAIAP2-DT、AC061992.1和AC008105.3為保護(hù)性因素，Z68871.1、LINC01235、AC090198.1為危險因素。目前，尚未見有關(guān)上述缺氧相關(guān)lncRNA在乳腺癌中的研究，但可見部分lncRNA在其他腫瘤中的研究。例如，SEMA3B和SEMA3B-AS1在食管癌細(xì)胞和食管鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)，且兩者在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；而過表達(dá)SEMA3B和SEMA3B-AS1可抑制食管癌細(xì)胞的體外活性和侵襲力[14]。LINC01235可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其在胃癌組織中高表達(dá)與預(yù)后不良呈正相關(guān)，是預(yù)后不良的獨(dú)立標(biāo)志物[15]?？梢姡@些lncRNA對其他腫瘤的影響，與本研究中對乳腺癌的影響相似。結(jié)合lncRNA的功能，我們推測缺氧相關(guān)lncRNA可能通過與微小RNA的相互作用、調(diào)控表觀遺傳基因和參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。今后，需要更多的研究來闡明缺氧相關(guān)lncRNA在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的功能和關(guān)鍵機(jī)制。因此，在后續(xù)的研究中，我們將針對以上與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)的lncRNA進(jìn)行進(jìn)一步基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和功能研究。

精準(zhǔn)基因組醫(yī)學(xué)的重點(diǎn)是從含有臨床結(jié)果的大型醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)中找出準(zhǔn)確、特異地預(yù)測生存預(yù)后的因素。因此，我們根據(jù)獲得的12個缺氧相關(guān)lncRNA構(gòu)建了風(fēng)險評分模型，并進(jìn)一步驗(yàn)證了該評分模型評估乳腺癌患者預(yù)后的價值。結(jié)果顯示，高風(fēng)險評分乳腺癌患者生存時間較短(P<0.05)，預(yù)后標(biāo)志的C指數(shù)為0.798，表明風(fēng)險評分對乳腺癌具有可靠和準(zhǔn)確的診斷作用。同時時間依賴性ROC曲線分析結(jié)果顯示，該評分預(yù)測乳腺癌患者1年、3年和5年生存情況均具有較好的效能(AUC值均>0.65)。由此可見，基于缺氧相關(guān)lncRNA的風(fēng)險評分有助于評估乳腺癌患者的預(yù)后。然而，乳腺癌患者的預(yù)后還可能受到其他臨床病理特征的影響。因此，我們將風(fēng)險評分與患者年齡、腫瘤分級、TNM分期作為自變量，采用多因素Cox回歸模型進(jìn)一步篩選乳腺癌患者預(yù)后的影響因素，并將所獲得的影響因素(患者年齡和風(fēng)險評分)通過繪制Nomogram圖構(gòu)建了風(fēng)險模型，ROC曲線分析結(jié)果表明該模型對乳腺癌患者的預(yù)后也具有較好的預(yù)測價值(AUC值為0.750)，且預(yù)測效能優(yōu)于腫瘤分級、TNM分期等指標(biāo)。 因此，除了常規(guī)的臨床病理特征，在臨床上還應(yīng)該根據(jù)相關(guān)基因的表達(dá)來評估患者的預(yù)后，從而更好地制定后續(xù)治療方案和隨訪措施。但本研究僅僅納入了部分臨床病理特征進(jìn)行預(yù)后分析，未考慮到治療方案等其他可能影響預(yù)后的因素，今后還應(yīng)納入更多的因素深入研究，以完善預(yù)測模型。

總之，本研究篩選出12個與乳腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)的缺氧相關(guān)lncRNA，由其組成的風(fēng)險評分模型對乳腺癌患者的預(yù)后有較好的預(yù)測價值，而結(jié)合相關(guān)臨床指標(biāo)與風(fēng)險評分綜合評估患者的預(yù)后，或可為制定遠(yuǎn)期的治療或隨訪方案提供更多的依據(jù)。今后可設(shè)計分子實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證缺氧相關(guān)lncRNA在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的確切分子機(jī)制。