王盛堯 陳 宇 譚順林

(四川省資陽市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，資陽市 641300，電子郵箱：wqp296@163.com)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是心肌梗死、心肌肥厚、心肌纖維化等心臟病變發(fā)展的終末階段，其致殘率、致死率均較高，且花費(fèi)高、預(yù)后差，是目前全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一[1-2]。心室重構(gòu)是CHF發(fā)生和發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)。心室出現(xiàn)心肌損傷或負(fù)荷增加，可引起基因調(diào)控的分子、細(xì)胞和心肌間質(zhì)發(fā)生變化，導(dǎo)致心肌收縮功能障礙和心室肥厚失代償，進(jìn)而引起心室重構(gòu)，是影響CHF發(fā)病率和病死率的重要因素[3]。因此，尋找有效生物學(xué)指標(biāo)早期評估及診斷CHF，并采取針對性措施進(jìn)行干預(yù)，對改善患者病情、提高預(yù)后有重要意義。

微小RNA(microRNA，miRNA)具有作為心血管疾病生物標(biāo)志物的潛在作用。Liu等[4]發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死模型大鼠血清中的miRNA-29b水平低于正常大鼠，miRNA-29b可能通過激活Notch信號通路抑制心肌纖維化和心肌肥大。血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是一類結(jié)締組織細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的促有絲分裂原和化學(xué)催化劑，可以刺激細(xì)胞分裂、增殖，參與多種血管性疾病的發(fā)生和發(fā)展[5]。研究表明，急性心肌梗死患者血清PDGF水平較健康人升高[6]?；趍iRNA-29b和PDGF在心肌疾病中均呈異常表達(dá)，本文分析CHF患者血清中miRNA-29b和PDGF的表達(dá)情況，探討二者與病情嚴(yán)重程度、心室重構(gòu)的相關(guān)性，以期為相關(guān)的臨床研究及指標(biāo)檢測提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2017年3月至2019年3月在本院心內(nèi)科住院治療的148例CHF患者作為CHF組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會制定的《中國心力衰竭診斷和治療指南2014》[7]中CHF的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)臨床資料完整；(3)自愿參與研究且中途無退出者；(4)患者家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近1個月內(nèi)行血管重建術(shù)者；(2)近3個月內(nèi)有急性心肌梗死、嚴(yán)重肝腎功能不全者；(3)近3個月內(nèi)有不穩(wěn)定型心絞痛者；(4)嚴(yán)重感染者及自身免疫性疾病患者；(5)惡性腫瘤患者；(6)近3個月內(nèi)使用過可能影響PDGF等檢測指標(biāo)的藥物或制劑者。148例CHF患者中男性82例、女性66例，年齡40～74(57.18±8.22)歲；根據(jù)美國紐約心臟病協(xié)會(New York Heart Association，NYHA)心功能分級標(biāo)準(zhǔn)[8]對CHF患者進(jìn)行分級，其中Ⅰ～Ⅱ 級47例(Ⅰ～Ⅱ級亞組)、Ⅲ級52例(Ⅲ級亞組)、Ⅳ級49例(Ⅳ級亞組)；發(fā)生心室重構(gòu)44例(心室重構(gòu)亞組)，未發(fā)生心室重構(gòu)104例(非心室重構(gòu)亞組)病程1～9(4.98±1.60)年；原發(fā)疾?。汗谛牟?4例，高血壓心臟病57例，心臟瓣膜病27例。另選取同期在本院體檢的150例健康者作為對照組，心臟功能均正常，無吸煙、飲酒史。其中男性81例、女性69例，年齡43～70(56.36±6.51)歲。本研究符合《赫爾辛基宣言》，經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)后實(shí)施，所有患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 臨床資料收集 收集研究對象的性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、基礎(chǔ)疾病情況等一般資料。

1.3 血清指標(biāo)的檢測

1.3.1 主要試劑與儀器：TRIzol試劑(貨號：MN562J2)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：J6547M)、熒光定量PCR試劑盒(貨號：N5643MJ)購自美國Sigma公司；miRNA-29b及內(nèi)參U6引物由上海生工生物工程有限公司合成；PDGF酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒(貨號：SEA480Hu-1)購自上海嵐派生物科技有限公司。熒光定量PCR分析儀(型號：YFGB1022)購自日本Olympus公司。

1.3.2 血清樣本的采集與保存：抽取所有研究對象(CHF組于入院次日清晨、對照組于健康體檢時)的空腹肘靜脈血5 mL，注入無菌離心管中混勻，室溫條件下以4 000 r/min離心10 min，取上清液，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清PDGF水平：從-80℃冰箱中取出凍存血清，解凍后采用酶聯(lián)免疫吸附法測定受試者血清中的PDGF水平。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4 實(shí)時熒光定量PCR法測定血清miRNA-29b表達(dá)水平：從-80℃冰箱中取出血清樣本，按照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照實(shí)時熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，所用引物序列見表1。反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Premix I Ex TaqTM10 μL、cDNA 1 μL、H2O 8 μL、上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)程序為95℃預(yù)處理20 s，95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，共40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算血清miRNA-29b的相對表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.3.5 基于生物信息學(xué)分析miRNA-29b與PDGF關(guān)系：基于生物信息學(xué)網(wǎng)站miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)預(yù)測miRNA-29b和PDGF的結(jié)合位點(diǎn)。

1.4 超聲心動圖檢查 由本院超聲科專職醫(yī)師使用美國HP5500型彩色多普勒超聲心動儀診斷系統(tǒng)，對所有研究對象進(jìn)行心臟彩色超聲檢查，測定左心功能。囑患者左側(cè)臥位，取胸骨旁左心室長軸切面，測定并記錄左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)、左心室舒張末期室間隔厚度、左心室后壁厚度、左心室舒張末期內(nèi)徑。根據(jù)Devereux等[9]提出的公式計算左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)，LVMI=左心室重量/體表面積，其中左心室重量=1.04×[(左心室舒張末期室間隔厚度+左心室后壁厚度+左心室舒張末期內(nèi)徑)3-左心室舒張末期內(nèi)徑3]-13.6，體表面積=0.006×身長(cm)+0.013×體重(kg)-0.153。所有參數(shù)均測量5個心動周期，取平均值。計算LVEDV增長率，即△LVEDV%=(LVEDV1-LVEDV0)/LVEDV0×100%，其中LVEDV0為CHF患者發(fā)病后4 d的LVEDV，LVEDV1為隨訪6個月時的LVEDV；將△LVEDV%≥20%定義為心室重構(gòu)[10]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，方差齊時兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；方差不齊時，兩組間比較采用Mann-Whitneyu檢驗，多組間比較則采用Kruskal-WallisH檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson檢驗進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組一般資料的比較 4組的性別、年齡、合并糖尿病情況、合并高血壓情況、體質(zhì)指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 4組一般資料的比較

2.2 不同心功能亞組CHF患者血清miRNA-29b和PDGF水平的比較 與對照組比較，各心功能亞組CHF患者血清miRNA-29b相對表達(dá)水平均降低，血清PDGF水平均增高(P<0.05)；Ⅰ～Ⅱ級亞組、Ⅲ級亞組、Ⅳ級亞組CHF患者的血清miRNA-29b相對表達(dá)水平依次降低，血清PDGF水平依次升高(均P<0.05)。見表2。

表2 不同心功能亞組CHF患者血清miRNA-29b相對表達(dá)水平和PDGF水平與對照組的比較(x±s)

2.3 心室重構(gòu)亞組和非心室重構(gòu)亞組CFH患者血清miRNA-29b相對表達(dá)水平和PDGF水平的比較 與非心室重構(gòu)亞組比較，心室重構(gòu)亞組CHF患者血清miRNA-29b相對表達(dá)水平降低，血清PDGF水平升高(均P<0.05)。見表3。

表3 心室重構(gòu)亞組與非心室重構(gòu)亞組CFH患者血清miRNA-29b相對表達(dá)水平和PDGF水平的比較(x±s)

2.4 4組超聲心動圖左心室重構(gòu)指標(biāo)的比較 與對照組比較，各亞組CHF患者的LVMI、LVEDV水平均升高，LVEF水平均降低(均P<0.05)；Ⅰ～Ⅱ級亞組、Ⅲ級亞組、Ⅳ級亞組CHF患者的LVMI、LVEDV水平依次升高，LVEF水平依次降低(均P<0.05)；Ⅲ級亞組、Ⅳ級亞組CHF患者的心室重構(gòu)率高于Ⅰ～Ⅱ級組患者(均P<0.05)。見表4。

表4 不同心功能亞組CHF患者超聲心動圖心室重構(gòu)指標(biāo)與對照組的比較

2.5 CHF患者血清miRNA-29b相對表達(dá)水平和PDGF水平的相關(guān)性 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，miRNA-29b和PDGF存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖1。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CHF患者血清miRNA-29b相對表達(dá)水平與血清PDGF水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.601，P<0.001)。

圖1 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果

2.6 CFH患者血清miRNA-29b相對表達(dá)水平和PDGF水平與左心室重構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)性 在CHF患者中，血清miRNA-29b表達(dá)水平與LVMI、LVEDV呈負(fù)相關(guān)(r=-0.538，P<0.001；r=-0.512，P<0.001)，與LVEF呈正相關(guān)(r=0.496，P<0.001)；血清PDGF水平與LVMI、LVEDV呈正相關(guān)(r=0.520，P<0.001；r=0.529，P<0.001)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.467，P<0.001)。

3 討 論

CHF是由于心臟收縮功能及舒張功能發(fā)生障礙，不能將靜脈回心血充分排出心臟，導(dǎo)致靜脈系統(tǒng)血液淤積、動脈血液灌注不足而引起心肌結(jié)構(gòu)異常和心功能不全的一種臨床綜合征，其是心血管疾病發(fā)展的終末階段[11]。左心室重構(gòu)是心血管事件中重要的靶器官損害及并發(fā)癥，是心臟對慢性容量和壓力超負(fù)荷的適應(yīng)性改變，可使心肌細(xì)胞肥大、纖維化，心肌代謝及電生理發(fā)生改變，導(dǎo)致左心室容積增大，最終導(dǎo)致CHF[12]。因此，探尋有效生物學(xué)指標(biāo)用于評估左心室重構(gòu)從而及時采取相應(yīng)措施進(jìn)行干預(yù)，對預(yù)防及治療CHF有重要意義。

miRNA為單鏈RNA分子，參與調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程[13]。越來越多研究表明miRNA在心血管疾病中發(fā)揮作用[14]。如劉志立等[15]研究報道，血清miRNA-29b表達(dá)水平降低與急性心肌梗死的發(fā)生有關(guān)，且可作為預(yù)測患者死亡的指標(biāo)之一；Zhu等[16]發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以通過誘導(dǎo)miRNA-29b表達(dá)上調(diào)來促進(jìn)血管生成，進(jìn)一步縮小小鼠心肌梗死面積，從而改善心臟功能；Wang等[17]發(fā)現(xiàn)，腎交感神經(jīng)去神經(jīng)支配可能通過上調(diào)miRNA-29b的表達(dá)來減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的左心室重構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，各亞組CHF患者的血清miRNA-29b相對表達(dá)水平低于對照組，且隨著心功能分級的增加而逐漸降低(均P<0.05)。這提示miRNA-29b異常低表達(dá)可能不僅與CHF的發(fā)生有關(guān)，同時也與病情嚴(yán)重程度關(guān)系密切。

PDGF是成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及其他間充質(zhì)來源細(xì)胞的強(qiáng)有絲分裂原和化學(xué)驅(qū)動劑，也是心血管系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子[18]。任良強(qiáng)等[19]發(fā)現(xiàn)，不穩(wěn)定型心絞痛患者治療后PDGF水平顯著低于治療前，且隨著NYHA心功能分級下降而逐漸降低。初志輝等[20]研究報道，穩(wěn)定型心絞痛患者血清PDGF水平明顯高于健康人群，且血清PDGF水平與患者冠狀動脈病變程度有一定關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示，各亞組CHF患者血清PDGF水平高于對照組，且隨著心功能分級的增加而逐漸升高(均P<0.05)，與上述研究結(jié)果相似。這提示PDGF水平異常高表達(dá)與CHF發(fā)生有關(guān)，同時也與病情嚴(yán)重程度關(guān)系密切。我們進(jìn)一步行生物信息學(xué)預(yù)測，結(jié)果提示miRNA-29b與PDGF的3′端非編碼區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，且相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CHF患者血清miRNA-29b相對表達(dá)水平與PDGF水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，提示miRNA-29b可能通過負(fù)調(diào)控PDGF影響CHF的發(fā)生和發(fā)展。

LVMI、LVEF、LVEDV是評價心室重構(gòu)的敏感性指標(biāo)，其中LVMI通過患者的左心室質(zhì)量及體表面積評估心臟生理情況[21]。Huang等[22]發(fā)現(xiàn)，與健康人群比較，原發(fā)性高血壓患者血清miRNA-29b相對表達(dá)水平與LVMI呈正相關(guān)，提示miRNA-29b或可反映原發(fā)性高血壓患者的靶器官損害情況。本研究中，對照組、Ⅰ～Ⅱ級組、Ⅲ級組、Ⅳ級組的LVMI和LVEDV依次升高，LVEF依次降低，且Ⅲ級組、Ⅳ級組CHF患者的心室重構(gòu)率明顯高于Ⅰ～Ⅱ 級組患者，CHF患者血清miRNA-29b相對表達(dá)水平與LVMI、LVEDV呈負(fù)相關(guān)，而與LVEF呈正相關(guān)，血清PDGF水平與LVMI、LVEDV呈正相關(guān)，而與LVEF呈負(fù)相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)心室重構(gòu)亞組CHF患者血清miRNA-29b相對表達(dá)水平明顯低于非心室重構(gòu)亞組，血清PDGF水平明顯高于非心室重構(gòu)亞組(均P<0.05)。以上結(jié)果表明CHF患者血清miRNA-29b相對表達(dá)水平降低、PDGF水平升高可能與心室重構(gòu)有關(guān)。

綜上所述，CHF患者血清miRNA-29b表達(dá)下調(diào)，而PDGF水平升高，兩者與病情嚴(yán)重程度及心室重構(gòu)關(guān)系密切，miRNA-29b可能通過靶向調(diào)控PDGF參與CHF的發(fā)生和發(fā)展。然而本研究樣本量較少，后期應(yīng)加大樣本量進(jìn)一步對miRNA-29b、PDGF在CHF及心室重構(gòu)中的具體作用機(jī)制進(jìn)行探討。