鄭琳，張勃，吳長(zhǎng)偉，李仙，蔣美紅

（常德華馥生物技術(shù)（有限）公司，云南昆明 650000）

雞嗉子果，別名山覆盆、野荔枝、山荔枝、山枇杷果等，為山茱萸科山茱萸屬植物頭狀四照花的果實(shí)，花期5—6月，果期9—10月。雞嗉子果生于海拔1 600～3 200 m的山坡常綠闊葉林中，林緣或路旁，分布于廣西、云南、貴州、四川、西藏、湖南、湖北以及浙江等地。以葉、果入藥，秋季采果，鮮用或曬干，葉四季可采，曬干研粉。花、葉和枝含山茱萸苷、根皮酚-β-D-葡萄糖苷，雞嗉子果有清熱解毒、利膽行水、消積殺蟲(chóng)的作用。

目前，雞嗉子果相關(guān)的研究多在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等方面，而在煙草領(lǐng)域，還未見(jiàn)雞嗉子果作為煙用添加劑使用的報(bào)道或產(chǎn)品。近年來(lái)，對(duì)于雞嗉子花、雞嗉子葉揮發(fā)油類化學(xué)成分分析等方面已有文獻(xiàn)報(bào)道[1-8]，雞嗉子果主要應(yīng)用在色素提取和酒精飲料領(lǐng)域，對(duì)雞嗉子果制備香精香料產(chǎn)品和超聲波連續(xù)逆流提取工藝方面的研究較為鮮見(jiàn)。運(yùn)用超聲逆流提取技術(shù)提取有效成分，可以有效降低生產(chǎn)成本[9-11]。

本研究以雞嗉子果為原料，采用超聲波連續(xù)逆流提取技術(shù)提取其主要致香成分，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)[12-17]確定了其主要致香成分的最佳提取條件，建立了最優(yōu)提取工藝，為工業(yè)生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試材料為雞嗉子果，產(chǎn)自云南省昆明市。

乙醇，食品級(jí)，汕滇藥業(yè)有限公司；無(wú)水硫酸鈉，AR，廣東汕頭市西隴化工廠；二氯甲烷，AR，天津市博迪化工有限公司。

NLTQ-SY超聲波連續(xù)逆流提取設(shè)備，哈爾濱申宜科技有限公司；Agilent 6890N/5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；HXC576血液冷藏箱，青島海爾特種電器有限公司；ME204E電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；NK-505粉碎機(jī)，中山市龍的電器實(shí)業(yè)有限公司；BUCHIR-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司；LXD-28A型電動(dòng)離心機(jī)，長(zhǎng)春市紙張?jiān)囼?yàn)廠；HG53型鹵素水分測(cè)定儀，瑞士Mettler Toledo公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 超聲波連續(xù)逆流提取工藝

向超聲波逆流提取機(jī)組內(nèi)加入乙醇溶劑，調(diào)節(jié)溫度至75 ℃，開(kāi)啟主機(jī)和超聲波發(fā)生器。稱取雞嗉子果2 kg，將其加入投料機(jī)漏斗，調(diào)節(jié)頻率，當(dāng)有排渣時(shí)打開(kāi)流量計(jì)閥門，調(diào)節(jié)流量計(jì)，在保持一定的料液比下進(jìn)行提取，以提取溫度、提取時(shí)間和溶劑濃度為參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，后收集分離釜中的提取物并進(jìn)行處理，對(duì)處理后的溶液進(jìn)行減壓濃縮即得雞嗉子果煙用香料。提取得率計(jì)算方法按式（1）計(jì)算。

式（1）中：m為雞嗉子果煙用香料質(zhì)量，g；M為雞嗉子果原料質(zhì)量，g。

1.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇提取時(shí)間、提取溫度和溶劑濃度作為超聲波逆流提取雞嗉子果試驗(yàn)的主要影響因素，以提取得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平編碼表

1.4 GC-MS分析條件

前處理：稱取1.00 g樣品，用10 mL二氯甲烷進(jìn)行溶解，并以適量無(wú)水硫酸鈉置于4 ℃冰箱脫水24 h后過(guò)濾，對(duì)濾液進(jìn)行分析，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行主要致香成分的檢測(cè)。

儀器檢測(cè)：HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 mm）毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；載氣：He，恒壓模式70 kPa；程序升溫：50 ℃保持1 min，以8 ℃/min速度升至160 ℃，保持2 min后再以8 ℃/min速度升至260 ℃，保持15 min；進(jìn)樣量：0.5 μL；分流比：25∶1；傳輸線溫度：280 ℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度：160 ℃；質(zhì)量范圍：35～455 aum；溶劑延遲：2 min。

檢測(cè)模式：SCAN和SIM同步。

譜圖檢索：所得圖譜以計(jì)算機(jī)譜庫(kù)（NIST05，Wiley275）進(jìn)行檢索，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖和有關(guān)文獻(xiàn)[18-20]，并用色譜峰面積歸一化法測(cè)定得各揮發(fā)性成分的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 試驗(yàn)結(jié)果

按照響應(yīng)面法的Box-Behnken Design（BBD）實(shí)驗(yàn)方案，采用3因素3水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

試驗(yàn)共設(shè)計(jì)了15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中有12個(gè)析因點(diǎn)（1～12）和3個(gè)中心點(diǎn)（13～15），中心點(diǎn)重復(fù)的目的是估計(jì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的純實(shí)驗(yàn)誤差，以其揮發(fā)性成分的提取率Y作為響應(yīng)面分析的響應(yīng)值。

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到雞嗉子果提取率（Y）對(duì)提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）和溶劑濃度（C）的二次多項(xiàng)回歸方程模型為：Y=44.79800+0.41375A+0.33250B+0.50625C+0.23750AB-0.26000AC+0.29750BC-0.79650A2-0.86400B2-0.35650C2。具體結(jié)果見(jiàn)表3。因素交互作用對(duì)雞嗉子果提取率的響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。由結(jié)果可以看出，該模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾很小。模型的決定系數(shù)R2為0.9971，調(diào)整后R2為0.9934，大于0.9，說(shuō)明模型能解釋提取率響應(yīng)值的變化，模型與實(shí)際情況擬合較好，可用于分析和預(yù)測(cè)超聲波連續(xù)逆流提取雞嗉子果的實(shí)際情況。

表3 回歸方程模型的方差分析結(jié)果

圖1 提取溫度（A）與提取時(shí)間（B）對(duì)提取得率影響的等高線圖及響應(yīng)面圖

圖2 提取溫度（A）、溶劑濃度（C）對(duì)提取得率影響的等高線圖及響應(yīng)面圖

圖3 提取時(shí)間（B）、溶劑濃度（C）對(duì)提取得率影響的等高線圖及響應(yīng)面圖

由表3可知，一次項(xiàng)A、B和C差異極顯著（P＜0.01），說(shuō)明提取溫度、提取時(shí)間和溶劑濃度對(duì)雞嗉子果提取率均有極顯著影響；二次項(xiàng)A2、B2和C2差異極顯著（P＜0.01），說(shuō)明提取溫度、提取時(shí)間和溶劑濃度對(duì)雞嗉子果提取率的影響均不是線性關(guān)系；AB、AC、BC交互項(xiàng)差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明3個(gè)因素的交互作用對(duì)雞嗉子果提取率均有顯著影響。

2.1.2 試驗(yàn)驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的可靠程度，按照最優(yōu)條件（提取溫度78.54 ℃，提取時(shí)間68.12 min，溶劑濃度76.92%）進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為了方便生產(chǎn)操作，實(shí)際確定最佳提取條件為提取溫度為75 ℃，提取時(shí)間為60 min，溶劑濃度為75%。雞嗉子果提取率的平均值為44.79%，與通過(guò)Design Expert軟件對(duì)經(jīng)手動(dòng)優(yōu)化后的回歸方程求解得到的預(yù)測(cè)值44.88%非常接近，說(shuō)明該模型是比較可靠的，響應(yīng)面法適用于對(duì)雞嗉子果的超聲波連續(xù)逆流提取進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

2.2 雞嗉子果樣品的揮發(fā)性成分分析

表4列出了雞嗉子果揮發(fā)性成分。從雞嗉子果的揮發(fā)性成分中共鑒定出42種化合物，利用歸一化測(cè)定了各種成分的峰面積，其主要成分為α-蒎烯、莰烯、角鯊烯、4-亞甲基-1-(1-甲基乙基)雙環(huán)[3.1.0]2-己烯等。

表4 雞嗉子果揮發(fā)性化學(xué)成分

續(xù)表4

3 結(jié)論

超聲波連續(xù)逆流提取雞嗉子果香料最佳提取條件為提取溫度75 ℃、提取時(shí)間60 min、溶劑質(zhì)量濃度75%。從揮發(fā)性成分分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，超聲波連續(xù)逆流提取工藝制備的雞嗉子果主要揮發(fā)性成分有α-蒎烯、莰烯、角鯊烯、4-亞甲基-1-(1-甲基乙基)雙環(huán)[3.1.0]2-己烯等。這些成分能提升卷煙香氣，柔和煙氣，添加使用可明顯提高卷煙的抽吸品質(zhì)，是一種可運(yùn)用于卷煙的煙用香料[21-27]。優(yōu)選得到的超聲波連續(xù)逆流提取工藝可行，通過(guò)該項(xiàng)研究為超聲波連續(xù)逆流提取技術(shù)開(kāi)辟經(jīng)濟(jì)、高效且定向大規(guī)模生產(chǎn)特色雞嗉子果香料的新途徑提供了參考。