胡居吾

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）

高尿酸血癥（Hyperuricemia，HUA）是指在正常嘌呤飲食狀況下，血液中尿酸（Uric Acid，UA）含量異常升高的異質(zhì)性疾病。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，HUA與痛風(fēng)、高血壓、高血脂、動脈硬化、冠心病、糖尿病以及肥胖癥等疾病密切相關(guān)。

蔓 三 七 [Gynura procumbens（Lour.） Merr.]，分布于我國廣東、海南、貴州、云南等地，越南、泰國、印度尼西亞和非洲也有分布，具有清熱解毒、止血止咳、活血通絡(luò)、提高人體免疫力和抗病毒能力、抗感冒、降“三高”、提高免疫力等功效[1]，是一種無毒級的藥食兼可的植物。有研究表明，蔓三七具有抗高尿酸作用[2]，但沒有文獻報道蔓三七對急性高尿酸血癥是否具有治療效果。

在前期研究中，考察了蔓三七葉粗提取物（MSQ1）對氧嗪酸鉀致小鼠急性高尿酸血癥治療效果[3]。結(jié)果表明，不同劑量組的MSQ1對由氧嗪酸鉀引起的高尿酸值無顯著性影響，其原因可能是蔓三七葉粗提取物純度不高、雜質(zhì)較多，功效成分含量不高，起不到效果。

因此，本文在蔓三七葉粗提取物（MSQ1）的基礎(chǔ)上，對其進行純化，得到蔓三七葉提取物（MSQ2），然后考察其在高尿酸血癥治療方面的效果。同時，選擇腹腔注射酵母膏和氧嗪酸鉀，建立一個穩(wěn)定可靠的小鼠急性高尿酸血癥模型，采用測定血清中尿酸值的變化評價蔓三七葉提取物（MSQ2）對急性高尿酸血癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

蔓三七葉，由江西華紫仁農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供。

8周齡健康雄性昆明小鼠（20～22 g），SPF級，購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010。動物房溫度21～24 ℃，相對濕度55%～62%。任何疑似非健康小鼠在試驗前均已剔除。

1.2 藥品與試劑

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），美國Sigma-Aldrich公司；酵母膏，美國賽默飛世爾科技公司；氧嗪酸鉀（PO），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和異綠原酸A、B、C標(biāo)準(zhǔn)品，成都曼斯特生物科技有限公司；氯化鈉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；UA試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器

3001型酶標(biāo)儀，上海賽默飛世爾公司；Sykam S-501型制備液相色譜，德國Sykam 公司，包括四元泵（S1130）、自動進樣器（S5300）、柱溫箱（S4115）、UV/Vis檢測器（S3250）以及用于數(shù)據(jù)收集和處理 的Clarity工 作 站；Shim-pack GIST C18column（4.6 mm×250 mm, 5μm）色譜柱，日本島津公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 蔓三七粗提取物的提取

蔓三七干葉10 kg，加入水200 kg，用檸檬酸調(diào)節(jié)提取液pH值至3.0，提取1.5 h后過濾，再加入水200 kg，用檸檬酸調(diào)節(jié)提取液pH值至3.0，提取1.0 h，合并提取液，濃縮，噴霧干燥（進風(fēng)溫度120 ℃，出風(fēng)溫度82 ℃），得蔓三七粗提取物（MSQ1）。

1.4.2 蔓三七粗提取物的純化

將蔓三七粗提取物（MSQ1）用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，真空濃縮回收乙酸乙酯，再進行真空冷凍干燥，得到蔓三七提取物（MSQ2）。

1.4.3 綠原酸及異綠原酸含量的測定

色譜條件：HPLC溶劑分別為H2O和0.1%乙酸（V/V）作為水溶劑（A）和甲醇作為有機溶劑（B）。

梯度洗脫方式：0～15 min，30%B；15～25 min，30% → 50%B；25～ 40 min，50%B；40～ 41 min，50%→30%B，41～50 min，30%B。柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測器波長為327 nm，進樣量為10 μL。

1.4.4 藥物配制

0.5%CMC-Na過濾后用于配制蔓三七提取物（MSQ2）低劑量（150 mg/mL）、中劑量（300 mg/mL）和高劑量（600 mg/mL）3個劑量組；用生理鹽水配制氧嗪酸鉀（30 mg/mL）；用滅菌水配制酵母膏（30 g/kg）。

1.4.5 動物分組和建模

小鼠在恒溫（23±2）℃，相對濕度50%～60%，光照、黑夜各12 h，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為5組，即正常對照組，模型組，蔓三七提取物（MSQ2）低劑量組（150 mg/kg）、中劑量組（300 mg/kg）和高劑量組（600 mg/kg），每組7只，給藥體積均為0.1 mL/kg。模型組和藥物組每天早、晚9點灌胃酵母膏，灌胃體積為0.1 mL/kg；每天上午9點灌胃酵母膏后立即腹腔注射PO，劑量為300 mg/kg，1 h后藥物組分別灌胃不同劑量蔓三七提取物，連續(xù)給藥7 d，正常對照組和模型組分別灌胃等體積的0.5%CMC-Na。

1.4.6 血清中尿酸的測定

小鼠麻醉后利用1 mL注射器心臟取血，將取出的血樣沿著1.5 mL EP管壁輕輕打出，室溫下靜置1 h后，在4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，取上清液按照UA試劑盒說明書測定吸光值并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清尿酸的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism8.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔓三七提取物（MSQ2）中綠原酸及異綠原酸的含量

綠原酸及異綠原酸A、B、C標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=26.325x-163.49，相關(guān)系數(shù)R2=0.9989；異綠原酸A、B、C標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=42.893x-398.69、y=24.119x-330.74、y=40.604x-381.62，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9980、0.9934、0.9983。通過峰面積，可以計算得到綠原酸及異綠原酸A、B、C的含量，見表1。

圖1 綠原酸及異綠原酸A、B、C標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 蔓三七粗提取物（MSQ2）中綠原酸及異綠原酸含量

2.2 尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

將5 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.5 μmol/mL、0.25 μmol/mL、0.125 μmol/mL、0.0625 μmol/mL、0.03125 μmol/mL和0.0156255 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照UA試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，混勻，37 ℃水浴反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀在505 nm處測定吸光值（A）。以各個標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，其對應(yīng)的ΔA為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。

圖2 尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 MSQ2對酵母膏和氧嗪酸鉀誘導(dǎo)小鼠高尿酸血癥的影響

如圖3所示，小鼠經(jīng)灌胃酵母膏和注射氧嗪酸鉀7 d后，模型組小鼠的血尿酸水平為120 mmol/L，與正常組小鼠相比上升了50%，差異性顯著（P＜0.05）；與模型組（Model）相比，蔓三七提取物（MSQ2）低劑量組（L-dose）、中劑量組（M-dose）、高劑量組（H-dose）均顯示出不同程度降低小鼠血尿酸水平（P＜0.05）。結(jié)果說明，蔓三七提取物（MSQ2）對酵母膏和氧嗪酸鉀誘導(dǎo)聯(lián)合誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠有顯著的降低尿酸作用。

圖3 蔓三七提取物（MSQ2）對高尿酸血癥小鼠血清尿酸的影響

3 結(jié)論

氧嗪酸鉀是一種競爭性尿酸酶抑制劑，可阻斷肝臟尿酸酶的作用，并在嚙齒類動物中產(chǎn)生尿酸，是適合嚙齒類動物的高尿酸造模用藥[4]。氧嗪酸鉀不溶于水，采用腹腔注射氧嗪酸鉀造模，采用合適的溶劑是成功的關(guān)鍵。0.5%羧甲基纖維素鈉是脂溶性物質(zhì)的常用助懸溶劑，可作為灌胃的輔料，不能作為腹腔注射溶液。因此，本文采用生理鹽水進行溶解氧嗪酸鉀，效果良好，可供借鑒使用。

本研究采用動物實驗進行造模，通過腹腔注射酵母膏和氧嗪酸鉀建立高尿酸血癥模型，將造模成功的KM小鼠采用不同劑量的蔓三七提取物（MSQ2）灌胃治療7 d后，蔓三七提取物（MSQ2）對酵母膏和氧嗪酸鉀誘導(dǎo)聯(lián)合誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠有顯著的降低尿酸作用。后期的研究工作中，將檢測血清中黃嘌呤氧化酶活性、SOD活性、GSH-Px活性、ROS活性，并開展蔓三七提取物（MSQ2）對尿酸鈉誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型的作用實驗，檢測蔓三七提取物（MSQ2）給藥后對大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度的影響，測定關(guān)節(jié)病理學(xué)變化，檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量的變化情況，為開發(fā)出具有市場競爭力的降低尿酸產(chǎn)品提供數(shù)據(jù)和理論支撐。