亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        重組海藻凝集素通過誘導(dǎo)細胞凋亡與自噬抑制宮頸癌細胞增殖

        2022-01-27 02:26:10陳思琦朱漪涵義塘葦曹國梅代益劉文權(quán)
        生物化工 2021年6期
        關(guān)鍵詞:凝集素二聚體孵育

        陳思琦,朱漪涵,義塘葦,曹國梅,代益,劉文權(quán)*

        (1.江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院檢驗教研室,江西上饒 334000;2.溫州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室,浙江溫州 325000)

        近年來,隨著我國政府大力推進宮頸癌的篩查工作,宮頸癌(HPV)疫苗的研發(fā)也取得了良好進展,對宮頸癌的防治起到了積極作用[1]。但由于需要疫苗接種的人群多、范圍廣,人們對接種疫苗的認知尚存在不足,加之進口疫苗價格高等因素,接種疫苗效果仍不甚理想。目前臨床化療藥大部分為廣譜殺傷性藥物,多通過化學(xué)合成,缺乏對腫瘤治療的靶向性和特異性,且存在不同程度的藥物毒性[2]。因此,尋找一種更安全、高效且特異性靶向?qū)m頸癌的藥物是當(dāng)前宮頸癌防治研究的重要目標(biāo)之一。

        凝集素(Lectin)屬于碳水化合物結(jié)合蛋白家族,廣泛存在于動植物和微生物中。凝集素對表面糖基化異常的多種腫瘤細胞均能產(chǎn)生細胞毒性或抑制生長,被認為是一種新的腫瘤治療候選藥物,現(xiàn)已證實一些植物凝集素主要通過誘導(dǎo)細胞凋亡和自噬途徑在體內(nèi)外表現(xiàn)出抗腫瘤活性[3]。

        海藻凝集素(Griffithsin,GRFT)是從海洋紅藻(Griffithsiasp.)中提取的一種含121個氨基酸、分子量為13 kDa的凝集素[4]。本研究采用MTT法檢測重組海藻凝集素rGRFT對幾種腫瘤細胞株的潛在抗增殖活性。在測試的幾種癌細胞中,發(fā)現(xiàn)宮頸癌HeLa細胞對rGRFT的敏感性較高,并以此為模型進一步探討了rGRFT抑制HeLa細胞增殖的分子機制。

        1 材料與方法

        1.1 試劑與儀器

        DAB顯色試劑盒,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Hoechst 33258染料,美國Sigma公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、Dulbecco's Modified Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、青霉素和鏈霉素,美國Gibco公司;Aelax-AnnexinV-PI試劑盒,美國invitrogen公司。

        抗 caspase-3、caspase-8、bcl-2、bax、Bid 和β-actin的一抗,美國Cell Signaling公司;HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗,美國biosharp公司;純化的葡萄糖、甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖,美國Sigma-Aldrich公司。

        人宮頸癌HeLa細胞、人包皮成纖維細胞(HFF)、人乳腺癌MCF-7細胞、人胰腺癌PANC-1細胞、人肝細胞癌細胞系HepG2,購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。

        SmartSpec Plus型分光光度計,美國Biorad公司ChemiScope 6000增強型化學(xué)發(fā)光成像儀,上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 重組GRFT二聚體的表達和純化

        編碼GRFT二聚體的基因GRFT-linker-GRFT交由TAKARA公司合成,并將其克隆至pUC載體。該基因由兩個編碼GRFT的基因通過柔性氨基酸鏈GS linker(GGSGGGSGGGSG)連接從而保證兩個GRFT基因表達后可形成相互獨立的單體結(jié)構(gòu)。構(gòu)建重組質(zhì)粒pColdⅢ-GRFT-linker-GRFT,轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)。經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)和測序鑒定后,將pColdⅢ-GRFT-linker-GRFT/BL21在37 ℃下培養(yǎng)過夜,將菌液以1∶20的比例轉(zhuǎn)入5 mL Amp+LB培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.6,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,15 ℃誘導(dǎo)表達22 h。收集細菌,用超聲波粉碎離心后取上清的可溶性蛋白通過0.22 μm的細菌濾器,加入平衡好的鎳NTA瓊脂糖凝膠預(yù)裝柱,用不同濃度的咪唑(10~500 mmol/L)洗脫液對重組GRFT蛋白進行純化。最后采用透析法去除無機鹽離子,BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

        1.2.2 細胞培養(yǎng)

        HFF、MCF-7和HepG2細胞使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),HeLa和PANC-1細胞用RPMI-1640培養(yǎng)。所有細胞均在37 ℃、5%CO2、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的條件下進行培養(yǎng)。收集指數(shù)生長期細胞進行增殖、凋亡、Western blot和PCR檢測。

        1.2.3 細胞增殖試驗

        采用MTT法檢測 rGRFT對 HeLa、PANC-1、HepG2、MCF-7和HFF細胞的影響。將細胞置于96孔培養(yǎng)板(5×104個/孔)中過夜培養(yǎng)12 h,細胞分別與 0 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、75 mmol/L和100 mmol/L的rGRFT共同孵育48 h,每孔加入25 μL的MTT試驗液(5 mg/mL),培養(yǎng)4 h后,取出培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO。渦旋混合后孵育10 min,用分光光度計測定590 nm處的吸光度。所有的實驗都至少進行3次。

        抑制率按照式(1)進行計算:

        式(1)中:A0和A1分別為對照組和藥物處理組在590 nm處的吸光值。

        1.2.4 單糖抑制實驗

        將rGRFT與葡萄糖、甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖三種單糖在37 ℃預(yù)孵育30 min,其他均與1.2.3方法相同。

        1.2.5 Hoechst33258染色觀察腫瘤細胞凋亡

        將HeLa細胞(5×104個/L)接種至鋪有蓋玻片的六孔板中培養(yǎng)過夜,次日加入IC50劑量的rGRFT孵育24 h后,棄掉培養(yǎng)基,PBS洗滌3次,加入Hoechst33258染料避光孵育10 min,挑出蓋玻片封片,在熒光顯微鏡下觀察HeLa細胞核的形態(tài)變化。

        1.2.6 Annexin-V/PI雙染檢測腫瘤細胞早期凋亡

        將HeLa細胞(5×105個/L)接種于60 mm培養(yǎng)皿中,加入50 μg/mL rGRFT處理24 h、48 h。處理后,將細胞消化洗滌離心(1 000 r/min,10 min)重懸于100 μL 1×AnnexinV緩沖液中,加入5 μL AnnexinV-488Aelax和1 μL PI,室溫避光孵育15 min,用流式細胞儀檢測早期凋亡細胞的百分比。

        1.2.7 Western blot

        將HeLa細胞(1.0×106個/L)接種于10 cm3的培養(yǎng)皿中,待細胞生長至對數(shù)生長期后,給予rGRFT處理。處理后的細胞用冰冷的PBS洗滌,再懸浮在含有1%PMSF的RIPA緩沖液中,4 ℃作用30 min。裂解細胞在12 500×g,4 ℃下離心5 min,收集上清液蛋白,用10% SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì),15 V轉(zhuǎn)膜25 min后,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,一抗分別用 Caspase3(1∶ 1 000)、Caspase8(1∶ 1 000)、Bax(1∶ 1 000)、Bcl-2(1∶ 1 000)、Bid(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)室溫孵育2 h,TBST緩沖液洗滌3次后分別用HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗及羊抗兔二抗(1∶5 000)稀釋室溫孵育1 h,使用增強型化學(xué)發(fā)光成像儀進行曝光顯影。

        1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

        實驗數(shù)據(jù)為至少3次獨立重復(fù)實驗的數(shù)據(jù),均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析,多組數(shù)據(jù)之間比較采用Dunnett檢驗,對兩組數(shù)據(jù)之間比較采用ANOVA單因素方差分析,P<0.05(*)和P<0.01(**)分別表示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)的顯著差異和極顯著差異。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 GRFT重組二聚體構(gòu)建及其對腫瘤細胞增殖的影響

        重組質(zhì)粒pColdⅢ-GRFT-linker-GRFT轉(zhuǎn)化至BL21細菌,加入IPTG誘導(dǎo)在15 ℃表達22 h,收集細菌后超聲裂解,將可溶性蛋白過Ni-NTA親和柱,目的蛋白主要在咪唑濃度為40~80 mmol/L時洗脫下來,Western blot分析結(jié)果表明,29 kDa處的二聚體條帶與14.5 kDa的兩個單一GRFT單位的結(jié)合大小是一致的(圖1a)。為了證實rGRFT二聚體與野生型蛋白具有相似的功能,用ELISA方法檢測了GRFT二聚體與HIV gp160的結(jié)合活性。與BSA的陰性對照相比,rGRFT能與gp160顯著結(jié)合(圖1b),這表明重組蛋白確為GRFT二聚體,并且與野生型蛋白具有幾乎相同的結(jié)構(gòu)和功能。

        采用MTT法檢測GRFT對多種腫瘤細胞的生長抑制作用,并以原代HFF細胞作為正常對照。實驗結(jié)果表明HeLa細胞對rGRFT更敏感,對MCF-7細胞和原代HFF細胞沒有明顯的細胞毒作用(圖1c)。

        圖1 重組GRFT蛋白的表達及其對腫瘤細胞增殖的影響

        因此,選擇HeLa細胞進行下一步的研究,以劑量和時間依賴的方式用rGRFT處理HeLa細胞,MTT法檢測rGRFT對HeLa細胞增殖的影響。結(jié)果顯示,rGRFT能誘導(dǎo)HeLa細胞死亡,尤其是隨著rGRFT濃度的升高(0~100 μg/mL),對HeLa細胞的生長有明顯的抑制作用(圖1d),25 μg/mL GRFT作用24 h后,抑制率達50%以上。

        通過單糖抑制實驗確定rGRFT的糖結(jié)合活性與其抗增殖活性之間的關(guān)系。采用不同濃度的rGRFT分別與葡萄糖、甘露糖和N-乙酰氨基葡糖(NAG)預(yù)孵育30 min后再進行增殖活性檢測。結(jié)果表明,單糖對rGRFT的抑癌作用沒有明顯的影響(圖1e)。提示rGRFT的抗腫瘤細胞增殖作用與其糖結(jié)合活性之間沒有聯(lián)系。

        2.2 rGRFT誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡

        誘導(dǎo)細胞凋亡是臨床放射療法和化學(xué)療法抗腫瘤的一個重要靶點,凋亡過程可以消除過度產(chǎn)生、發(fā)育不正?;蚧驌p傷的細胞[5]。為驗證rGRFT誘導(dǎo)的自噬作用,通過Hoechst33258染色觀察凋亡腫瘤細胞的細胞核形態(tài)變化。在熒光顯微鏡下觀察到經(jīng)50 μg/mL rGRFT處理后,HeLa細胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變,如染色質(zhì)聚集、核碎裂及出現(xiàn)凋亡小體。而未處理組(0 h)仍為正常圓形、均勻染色的細胞核。然而,50 μg/mL rGRFT在24 h或48 h處理后沒有引起HFF細胞明顯的凋亡形態(tài)。提示rGRFT可選擇性地誘導(dǎo)HeLa細胞晚期凋亡,但不能誘導(dǎo)非癌性HFF細胞凋亡。

        用Annexin-V/PI雙染后,使用流式細胞儀檢測rGRFT誘導(dǎo)的早期凋亡細胞百分比,以區(qū)分活細胞(Annexin V2/PI2)、早期凋亡細胞(Annexin V+/PI2)、晚期凋亡細胞(Annexin V+/PI+)和壞死細胞(Annexin V2/PI+)。PBS處理的HeLa細胞存活率為95.1%,隨著rGRFT加入濃度從25 μg/mL提高至50 μg/mL,細胞存活率從74.8%逐漸下降到43.5%,早期和晚期凋亡細胞比例從25%增加到53%。該結(jié)果MTT試驗一致,證實rGRFT蛋白能誘導(dǎo)HeLa細胞早期凋亡。

        2.3 rGRFT激活HeLa細胞凋亡信號通路

        采用50 μg/mL rGRFT處理24 h和48 h HeLa細胞,Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Pro-caspase3、Caspase3、Pro-caspase8和Caspase8相對表達水平,探討rGRFT誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡的可能機制。結(jié)果表明,rGRFT激活HeLa細胞中的原天冬氨酸蛋白8(Pro-caspase8)和原半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Pro-caspase3),產(chǎn)生相應(yīng)的43 kDa和17 kDa的切割片段,在48 h時效果最顯著(圖2a)。

        圖2 rGRFT激活HeLa細胞凋亡信號通路的檢測

        此外,還發(fā)現(xiàn)50 μg/mL rGRFT能激活線粒體膜上的Bcl-2家族。結(jié)果表明,rGRFT可顯著提高HeLa細胞線粒體膜上促凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表達水平,降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,Bax/Bcl-2比值與對照組(0 h)相比有顯著性差異(P<0.05),均為Caspase和線粒體依賴性凋亡的特征,提示rGRFT通過線粒體途徑促進HeLa細胞凋亡(圖2b)。

        2.4 rGRFT誘導(dǎo)HeLa細胞自噬的檢測

        Western blot結(jié)果顯示,經(jīng)rGRFT處理后,HeLa細胞中LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ,與未處理對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3a)。免疫熒光分析顯示,rGRFT處理的HeLa細胞LC3呈聚集分布,而對照組呈彌漫分布,處理后24 h組熒光強度與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3b)。

        圖3 rGRFT誘導(dǎo)HeLa細胞自噬的檢測

        3 結(jié)論

        許多報道表明,凝集素通過其碳水化合物結(jié)合能力誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。玉竹凝集素是從中草藥玉竹(Polygonatum odoratum)中提取的甘露糖結(jié)合凝集素(GNA)相關(guān)的凝集素家族。甘露糖α(1,3和1,6)可抑制甘露糖對人非小細胞肺癌A549細胞的誘導(dǎo)凋亡作用[6]。相反,本研究表明,應(yīng)用半乳糖不能抑制rGRFT對腫瘤細胞的抗增殖作用,rGRFT通過其他結(jié)構(gòu)域而不是其半乳糖結(jié)合域與腫瘤細胞相互作用。

        本研究結(jié)果證實,與其他凝集素類似,GRFT通過誘導(dǎo)細胞凋亡和激活自噬信號通路在HeLa細胞中發(fā)揮其死亡誘導(dǎo)作用。隨著培養(yǎng)時間的延長,rGRFT處理的HeLa細胞早期和晚期凋亡細胞增加,而存活細胞下降。rGRFT處理導(dǎo)致Caspase3/9激活,細胞色素C釋放,線粒體膜電位降低,促凋亡的Bax和Bid上調(diào),抗凋亡的Bcl-2和Bcl-xl下調(diào),PARP斷裂,這些都是Caspase和線粒體依賴性凋亡的特征。除凋亡外,rGRFT還誘導(dǎo)HeLa細胞發(fā)生自噬,表現(xiàn)為經(jīng)rGRFT作用后HeLa細胞LC3呈聚集分布,而對照組LC3呈彌散狀態(tài),表明促進LC3-I的表達和向LC3-II的轉(zhuǎn)化。

        現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的許多植物凝集素雖然對癌癥細胞有一定的抑制效應(yīng),但對正常細胞總是表現(xiàn)出不良的副作用。本研究發(fā)現(xiàn)rGRFT對HeLa細胞有較強的毒性作用,同時不表現(xiàn)出人類T細胞有絲分裂活性,也不會誘導(dǎo)經(jīng)過處理的人類細胞系(如外周血單個核細胞(PBMC)和宮頸陰道細胞)產(chǎn)生促炎細胞因子[7],安全性較高。因此,GRFT在安全性方面比其他植物凝集素更具吸引力,本研究結(jié)果將為開發(fā)GRFT類抗宮頸癌藥物以及預(yù)防HIV感染提供新的方向。

        猜你喜歡
        凝集素二聚體孵育
        三物黃芩湯組分(群)配伍在大鼠肝微粒體孵育模型中的相互作用
        中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:27
        Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
        大鼠肝微粒體孵育體系中2種成分的測定及其代謝
        中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
        半乳糖凝集素-3與心力衰竭相關(guān)性
        D-二聚體和BNP與ACS近期不良心血管事件發(fā)生的關(guān)聯(lián)性
        半乳糖凝集素-3在心力衰竭中的研究進展
        聯(lián)合檢測D-二聚體和CA153在乳腺癌診治中的臨床意義
        兩種試劑D-二聚體檢測值與纖維蛋白降解產(chǎn)物值的相關(guān)性研究
        D-二聚體檢測參考區(qū)間的驗證與分析
        半乳糖凝集素3與急性缺血性腦卒中的相關(guān)性研究
        亚洲av色av成人噜噜噜 | 久久精品国产亚洲av瑜伽| 亚洲AV无码一区二区一二区色戒| 在线视频自拍视频激情| 国产一区二区三区久久精品| 日本公妇在线观看中文版| 久久精品国产6699国产精| 日韩精品久久伊人中文字幕| 国产精品久久久久久妇女| 亚洲av成人一区二区三区| 一本一本久久久久a久久综合激情| 北岛玲亚洲一区二区三区| 中文字幕一区二区三区四区五区| 青草视频在线播放| 国产精品av在线一区二区三区| 偷拍视频十八岁一区二区三区| 成人艳情一二三区| 无码精品a∨在线观看十八禁| 乱色视频中文字幕在线看| 男女性行为免费视频网站 | 无码综合天天久久综合网| 色窝窝无码一区二区三区2022| 伊人狼人激情综合影院| 亚洲a∨无码精品色午夜| 人妻少妇精品视中文字幕国语| 国产在线AⅤ精品性色| 亚洲最大一区二区在线观看| 日产学生妹在线观看| 久久99热精品这里久久精品| 亚洲av第二区国产精品| 少妇久久久久久被弄高潮| 人妻少妇精品视中文字幕国语| 一本色道久久综合中文字幕| 国产乱码精品一区二区三区久久 | 久久99亚洲综合精品首页| 在线日本国产成人免费精品| 女人被弄到高潮的免费视频 | 久久老子午夜精品无码怎么打| 久久精品国产乱子伦多人| 久久这里都是精品99| 中文无码久久精品|