朱欣樂， 陳思宇， 楊正， 劉晶， 黃元昊， 彭英杰， 蘭時樂

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

人類需要從食物中攝取蛋白質(zhì)以維持正常的生命活動。水產(chǎn)品、谷類和牛奶是食物蛋白質(zhì)的主要來源，其中水產(chǎn)品約占蛋白質(zhì)總供應(yīng)量的6.5%[1]。隨著消費者對水產(chǎn)品需求量的增加，促使了水產(chǎn)高密度養(yǎng)殖模式的快速發(fā)展，同時也導(dǎo)致了養(yǎng)殖水體日益嚴(yán)重的富營養(yǎng)化問題，而氮是導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化的關(guān)鍵元素[2]。養(yǎng)殖水體中的氮污染物主要包括有機氮化物以及NH4+-N、NO2--N、NO3--N等無機氮。目前，國內(nèi)外許多科研工作者對水體中無機氮的去除進行了大量卓有成效的研究[3-6]，但有機氮的氨化過程研究較少。氨化作用是水體中有機氮去除的起始環(huán)節(jié)，直接影響到后續(xù)除氮進程[7]。氨化細(xì)菌將有機氮降解為NH4+-N，再通過硝化作用和反硝化作用轉(zhuǎn)化為N2O、N2[8-9]，以此實現(xiàn)水體脫氮。

目前已報道的氨化細(xì)菌主要包括Bacillus[10]、Pseudomonas[2,11]、Micrococcus[12]、Arthrobactersp.[2]、Lysinibacillusfusiformis[13]、Stenotrophomonasmaltophilia[14]、Enterobacteraerogenes[15]等。本試驗從精養(yǎng)池塘底泥中分離純化得到10株具有氨化能力的芽孢桿菌，根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA序列分析的方法鑒定菌株ZXL-7，初步探討培養(yǎng)基組成對菌株ZXL-7氨化能力的影響，為氨化細(xì)菌用于養(yǎng)殖水體中有機氮降解提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種分離樣品來源

菌種分離樣品采集于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地精養(yǎng)池塘底泥。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：魚粉1%，葡萄糖2%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，pH 7.2。

平板分離培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。

種子液培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，蛋白胨1%，pH 7.2。

斜面培養(yǎng)基：在種子液培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。

分離培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，NaCl 0.025%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.2。

氨化培養(yǎng)基[16]：葡萄糖3%，豆粕粉1.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，MnSO4·H2O 0.05%，NaCl 0.3%，pH 7.2。

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]配制生理生化鑒定培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌種初篩

稱取10 g底泥樣品接種至100 mL加有玻璃珠的富集培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)4 d，吸取10 mL富集液于90 mL無菌水中，置于80 ℃水浴鍋中處理15 min。按照10倍稀釋法逐級稀釋，取0.1 mL梯度為10-5、10-6、10-7的稀釋液分別涂于分離培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)至菌落生長。挑取不同形態(tài)的菌落進行多次劃線分離。選擇純化的菌落轉(zhuǎn)接于斜面保存。

1.2.2 菌種復(fù)篩

將分離得到的菌株接種到種子液培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h。按5%(V/V)接種量把菌液分別接種到氨化培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)48 h，測定培養(yǎng)液中NH4+-N含量。3次重復(fù)。

1.2.3 菌種鑒定

(1)形態(tài)學(xué)觀察。將菌株ZXL-7接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察菌落形態(tài)特征，并進行革蘭氏染色。

(2)生理生化試驗。按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行試驗。

(3)16S rDNA序列分析。通過Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株總基因組DNA，以通用引物27F(AGTTTGATCMTGGCTC)、1492R(GGTTACCTTGTTACGA)擴增16S rDNA。表1、2為PCR擴增反應(yīng)體系、反應(yīng)條件。PCR純化產(chǎn)物由上海生物工程股份有限公司完成測序。測序結(jié)果通過BLAST程序與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，利用軟件Mega7.0(neighbor-joining法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中Boot-strap分析重復(fù)設(shè)置為1 000。

表1 PCR擴增反應(yīng)體系Table 1 PCR amplification reaction system

表2 PCR擴增反應(yīng)條件Table 2 PCR amplification reaction conditions

1.2.4 氨化培養(yǎng)基研究

改變氨化培養(yǎng)基中碳源種類(酒石酸鉀鈉、乙酸鈉、丁二酸鈉、葡萄糖、蔗糖、淀粉、檸檬酸鈉)、碳源添加量(20、25、30、35、40 g/L)、氮源種類(豆粕粉、酵母粉、酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨)、KH2PO4添加量(1、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L)、MgSO4·7H2O添加量(0.5、1、1.5、2.0、2.5 g/L)、MnSO4·H2O添加量(0、0.25、0.5、0.75、1 g/L)等研究各因素對菌株氨化效果的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化

以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，選擇對氨化效果有顯著影響的丁二酸鈉(A)、KH2PO4(B)、MgSO4·7H2O(C)、MnSO4·H2O(D)為4個因素，以氨氮增加量(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗原理，進行四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗。因素與水平如表3所示。

表3 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 3 Level and factors design of response surface

1.3 氨氮含量測定

將培養(yǎng)液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，以未接種的氨化培養(yǎng)基作為空白對照，采用納氏試劑分光光度法測定上清液中NH4+-N含量(氨氮增加量等于菌液中氨氮含量減去空白培養(yǎng)基中氨氮含量，單位：mg/L)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel、Mega7、GraphPad Prism等軟件進行數(shù)據(jù)處理以及繪圖，利用Design Expert軟件進行模型擬合和方差分析。所有試驗進行3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨化細(xì)菌初篩和復(fù)篩結(jié)果

從精養(yǎng)池塘底泥中共分離出10株具有氨化作用的菌株。將菌株分別接種到氨化培養(yǎng)基中，于30 ℃、170 r/min搖床中培養(yǎng)48 h，測定培養(yǎng)液中NH4+-N含量，以空白培養(yǎng)基為對照。結(jié)果見表4。

由表4可知，不同菌株氨化能力不同，菌株ZXL-7的氨化能力最強，NH4+-N含量達到256.523 mg/L。故選擇菌株ZXL-7進行后續(xù)研究。

2.2 氨化細(xì)菌ZXL-7的鑒定

2.2.1 氨化細(xì)菌ZXL-7的形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

菌株形態(tài)如圖1所示。菌落為圓形，灰白色，不透明，表面濕潤，邊緣規(guī)則，無色素產(chǎn)生。菌體為桿狀，兩端鈍圓，芽孢橢圓形，中生，革蘭氏陽性(圖2)。

表4 菌株篩選結(jié)果Table 4 The results of strain screening

圖1 菌株ZXL-7菌落形態(tài)Figure 1 Colony morphology of ZXL-7

圖2 菌株ZXL-7菌體及芽孢形態(tài)Figure 2 Morphology of bacteria and spores of strain ZXL-7

生理生化試驗結(jié)果見表5。

表5 生理生化試驗結(jié)果Table 5 Physiological and biochemical experiments results

圖3 菌株ZXL-7 16S rDNA電泳圖Figure 3 16S rDNA electrophoresis of strain ZXL-7

2.2.2 16S rDNA序列分析結(jié)果

菌株16S rDNA擴增序列電泳結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，獲得的16S rDNA片段大小為1 489 bp。將測序結(jié)果與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫經(jīng)BLAST程序比對分析，利用軟件Mega7(neighbor-joining法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果見圖4。

對比發(fā)現(xiàn)菌株ZXL-7與NR-117473.1:1-1488Bacillusmegateriumstrain ATCC 14581的同源性高達100%。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定和分子生物學(xué)分析結(jié)果，鑒定菌株ZXL-7為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。

2.3 氨化培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 碳源種類對菌株ZXL-7氨化效果的影響

分別以3%的酒石酸鉀鈉、乙酸鈉、丁二酸鈉、蔗糖、淀粉、檸檬酸鈉替代氨化培養(yǎng)基中的葡萄糖，于30 ℃、170 r/min條件下培養(yǎng)36 h，測定培養(yǎng)液中NH4+-N含量，以空白培養(yǎng)基作為對照，并計算培養(yǎng)基中氨氮增加量。結(jié)果如圖5所示。

圖4 菌株ZXL-7 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain ZXL-7

圖5 碳源種類對菌株ZXL-7氨化效果的影響Figure 5 Effect of carbon sources on ammoniation of strain ZXL-7

圖5結(jié)果表明，不同碳源對菌株ZXL-7的氨化能力作用差異較大。當(dāng)以丁二酸鈉作為碳源時，菌株ZXL-7的氨化能力最強，培養(yǎng)液中氨氮增加量達325.926 mg/L。故選擇丁二酸鈉作為碳源進行后續(xù)研究。

2.3.2 丁二酸鈉添加量對菌株ZXL-7氨化效果的影響

在培養(yǎng)基中分別添加20、25、30、35、40 g/L的丁二酸鈉，于30 ℃、170 r/min條件下培養(yǎng)36 h，測定培養(yǎng)液中NH4+-N含量，以空白培養(yǎng)基作為對照，并計算培養(yǎng)基中氨氮增加量。結(jié)果見圖6，在一定范圍內(nèi)培養(yǎng)液中氨氮增加量隨丁二酸鈉添加量的增加而上升，當(dāng)丁二酸鈉添加量為25.0 g/L時，氨氮增加量最高達366.67 mg/L，但當(dāng)丁二酸鈉添加量繼續(xù)增加時，氨氮增加量下降。

圖6 丁二酸鈉添加量對菌株ZXL-7氨化效果的影響Figure 6 Effect of sodium succinate addition on ammoniation effect of strain ZXL-7

2.3.3 氮源種類對菌株ZXL-7氨化效果的影響

以氨化培養(yǎng)基中的含氮量為基礎(chǔ)，分別加入等氮量的豆粕粉(1.5%)、酵母粉(1.5%)、蛋白胨(0.662%)、酵母提取物(0.873%)、胰蛋白胨(0.756%)，于30 ℃、170 r/min條件下培養(yǎng)36 h，測定培養(yǎng)液中NH4+-N含量，以空白培養(yǎng)基作為對照，并計算培養(yǎng)基中氨氮增加量。結(jié)果見圖7。

圖7 氮源種類對菌株ZXL-7氨化效果的影響Figure 7 Effect of nitrogen sources on ammoniation of strain ZXL-7

從圖7可以看出，以酵母粉為氮源時氨氮增加量顯著低于其它氮源且差異不顯著，原因可能是酵母粉是鮮酵母乳經(jīng)分離洗滌、干燥后制得，其蛋白質(zhì)存在于細(xì)胞內(nèi)，微生物利用速度和效率較低所致。當(dāng)以酵母提取物為氮源時，氨氮增加量最大，為465.74 mg/L。因此選擇酵母提取物為氮源進行后續(xù)研究。

2.3.4 KH2PO4添加量對菌株ZXL-7氨化效果的影響

磷是微生物進行正常生命活動所必需的關(guān)鍵元素之一，是細(xì)胞中包括蛋白質(zhì)、核酸等生物分子的重要組成，若培養(yǎng)基中缺磷，將影響微生物核酸、磷脂等生物大分子物質(zhì)的合成以及正常代謝過程。圖8結(jié)果表明，當(dāng)KH2PO4添加量為2.00 g/L時，培養(yǎng)液中氨氮增加量最大，為498.61 mg/L，但KH2PO4添加量繼續(xù)增加，氨氮增加量下降。故選擇KH2PO4添加量為2.00 g/L進行后續(xù)研究。

圖8 KH2PO4添加量對菌株ZXL-7氨化效果的影響Figure 8 Effect of KH2PO4 addition on ammoniation of strain ZXL-7

2.3.5 MgSO4·7H2O添加量對菌株ZXL-7氨化效果的影響

鎂離子是微生物細(xì)胞中多種關(guān)鍵調(diào)控酶的活性中心組分，參與多種酶促反應(yīng)并維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。從圖9可以看出，氨氮增加量呈先升后降的趨勢。當(dāng)MgSO4·7H2O添加量為1.50 g/L時，氨氮增加量達到509.72 mg/L，但MgSO4·7H2O添加量繼續(xù)增加，氨氮增加量下降。原因是培養(yǎng)基中Mg2+濃度太高，對微生物細(xì)胞產(chǎn)生毒性。因此，選擇MgSO4·7H2O添加量為1.50 g/L進行后續(xù)研究。

圖9 MgSO4·7H2O添加量對菌株ZXL-7氨化效果的影響Figure 9 Effect of MgSO4·7H2O addition on ammoniation of strain ZXL-7

2.3.6 MnSO4·H2O添加量對菌株ZXL-7氨化效果的影響

錳本身不構(gòu)成微生物細(xì)胞組分，但參與超氧化物歧化酶、檸檬酸合成酶等酶的組成，并對芽孢的形成具有一定的促進作用。圖10結(jié)果表明，氨氮增加量在0.50 g/L MnSO4·H2O添加量下有最大值512.96 mg/L，但MnSO4·H2O添加量超過0.50 g/L時，氨氮增加量呈下降趨勢。

圖10 MnSO4·H2O添加量對菌株ZXL-7氨化效果的影響Figure 10 Effect of MnSO4·7H2O addition on ammoniation of strain ZXL-7

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

試驗結(jié)果見表6。

通過Design Expert12.0.3.0軟件進行方程擬合與顯著性分析，得到了氨氮增加量的二次多元回歸方程：

Y=574.31+44.28A+27.61B+35.95C-27.53D-

20.50AB-11.09AC-27.19AD-44.26BC-

7.56BD+9.39CD-45.93A2-59.74B2-

57.31C2-38.04D2

對回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表7。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken tests

表7 回歸方程方差分析Table 7 Analysis of regression model

由表7可知，模型P<0.000 1為極顯著，失擬項P=0.388 1>0.05，失擬度不顯著，說明模型可行；相關(guān)系數(shù)R2=0.981 9，表示本實驗響應(yīng)值氨氮增加量同各因素之間相關(guān)性良好；校正決定系數(shù)R2=0.963 8，變異系數(shù)C.V.%=3.12，說明該模型有良好的重現(xiàn)性，變異程度低。結(jié)合表中P值可知，丁二酸鈉(A)、KH2PO4(B)、MgSO4·7H2O(C)、丁二酸鈉和MnSO4·H2O的交互項(AD)、KH2PO4和MgSO4·7H2O的交互項(BC)以及丁二酸鈉的二次項(A2)、KH2PO4的二次項(B2)、MgSO4·7H2O的二次項(C2)、MnSO4·H2O的二次項(D2)為極顯著水平(P<0.01)，MnSO4·H2O(D)、丁二酸鈉和KH2PO4的交互項(AB)為顯著水平(P<0.05)，其它因素影響較小。

通過Design Expert12.0.3.0軟件對氨氮增加量的回歸方程進行分析，丁二酸鈉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O各因素交互作用的響應(yīng)面見圖11。

從圖11可以看出，丁二酸鈉和MnSO4·H2O、KH2PO4和MgSO4·7H2O之間的交互作用極顯著(P<0.01)，丁二酸鈉和KH2PO4的交互作用顯著(P<0.05)，而丁二酸鈉和MgSO4·7H2O、KH2PO4和MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O之間的交互作用均不顯著。

根據(jù)模型可以得出適宜的優(yōu)化培養(yǎng)基組成為：丁二酸鈉添加量為28.04 g/L，KH2PO4添加量為2.05 g/L，MgSO4·7H2O添加量為1.58 g/L，MnSO4·H2O添加量為0.61 g/L，此時氨氮增加量理論產(chǎn)量為600.005 mg/L。將優(yōu)化所得培養(yǎng)基組成進行三次重復(fù)試驗驗證，得到氨氮增加量分別為590.556、583.661、598.889 mg/L，平均值為591.035 mg/L，與預(yù)測值相差1.49%。說明該回歸模型可以用來優(yōu)化菌株ZXL-7氨化培養(yǎng)基組成，并且具有一定的準(zhǔn)確性。

圖11 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Figure 11 Response surface diagram of interaction of various factors

3 討論

本研究以蛋白胨為唯一氮源及高溫處理法從精養(yǎng)池塘底泥中分離得到10株具有氨化能力的芽孢桿菌，根據(jù)細(xì)菌經(jīng)典鑒定法并結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，菌株ZXL-7鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。王娟[18]、侯穎[19]分別從南美白對蝦養(yǎng)殖池、養(yǎng)魚池水中分離篩選到氨化性能較高的巨大芽孢桿菌(Bacill-us megaterium)，并研究了其對有機氮的降解效果。

目前研究表明，細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌等均具有降解有機氮的能力，但不同菌種對有機氮的降解能力不同。殘餌是養(yǎng)殖水體中營養(yǎng)成分的主要來源，同時也是水體的主要污染物[20]。水體中的碳源、氮源等直接影響外源益生菌對水體的修復(fù)作用[21-23]。本研究表明，在以丁二酸鈉為碳源、酵母提取物為氮源的條件下，菌株ZXL-7具有較強有機氮的降解能力，說明碳氮源種類和含量影響?zhàn)B殖水體中有機氮向氨氮的轉(zhuǎn)化，進而影響?zhàn)B殖水體中氮素的去除。磷元素、亞鐵等金屬離子均可影響微生物的脫氮能力[24-26]。當(dāng)環(huán)境中缺乏磷時，可降低糖類代謝速度，并可延遲生物濾池的啟動時間[27]。礦質(zhì)元素雖不參與細(xì)胞骨架的組成，但對酶的激活有重要作用。在培養(yǎng)基中添加適量濃度的磷酸鹽、Mg2+等均可提高菌株ZXL-7對有機氮的降解能力。本試驗篩選得到的巨大芽孢桿菌ZXL-7能有效降低養(yǎng)殖水體中有機氮的含量，并可應(yīng)用于養(yǎng)殖水體氮污染物的去除，但對有機氮的降解條件和機理、安全性以及使用方法等還有待進一步研究。

4 結(jié)論

本試驗采用平板分離法從精養(yǎng)池塘底泥中篩選得到1株高效氨化芽孢桿菌ZXL-7。通過經(jīng)典鑒定法并結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)手段菌株ZXL-7鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，利用響應(yīng)面法進行優(yōu)化，最終確定了巨大芽孢桿菌ZXL-7適宜的氨化培養(yǎng)基組成為：丁二酸鈉28.04 g/L，KH2PO42.05 g/L，MgSO4·7H2O 1.58 g/L，MnSO4·H2O 0.61 g/L，酵母提取物8.73 g/L，NaCl 3 g/L，此條件下，氨氮增加量達591.035 mg/L。說明本研究篩選的菌株可以用于養(yǎng)殖水體有機氮的降解，具有潛在的應(yīng)用價值。