凌海燕， 李春沁， 楊安東， 朱 寧,2*

(1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137)

杜仲為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹皮，功效補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎[1]，含有木脂素、環(huán)烯醚萜、苯丙素、多糖等多種活性成分，具有降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、保肝、護(hù)腎、抗骨質(zhì)疏松等藥理作用[2-3]。其中，木脂素有著降血壓、抗骨質(zhì)疏松、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)受損皮膚作用[4-8]，并且松脂醇二葡萄糖苷為杜仲主要特征性、功能性成分[9]，具有對血壓的雙向調(diào)節(jié)活性。Xie等[10]將杜仲皮松脂醇二葡萄糖苷與人糞便懸浮液厭氧培養(yǎng)，得到11種代謝產(chǎn)物，推測其復(fù)雜的腸道代謝或肝臟首過代謝產(chǎn)物可能是其藥理作用來源。

微粒體體外代謝試驗快速簡便，可直接觀察酶與底物之間的相互選擇性作用，減少了諸多體內(nèi)因素的干擾，能作為體內(nèi)外整體研究可靠的理論來源[11]，其中肝微粒體是最有效的手段。目前，國內(nèi)外尚未見松脂醇二葡萄糖苷在肝微粒體中代謝的報道，故本實驗采用高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(HPLC/QQQ-MS)法比較該成分在人和大鼠肝微粒體中的代謝，以期為該成分藥理活性及作用機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent 6410B三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；XS205電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；MIX-25渦旋振蕩器(杭州米歐儀器有限公司)；Heraeus Multifuge X1R冷凍離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；CASCADA Ⅱ超純水機(jī)(美國Pall life Science公司)；DZKW-4電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；KH7200E超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 松脂醇二葡萄糖苷(成都普思生物科技股份有限公司，批號PS000870)；氯霉素(四川省維克奇生物科技有限公司，批號wkq20051911)。PBS緩沖液(北京匯智泰康生物科技有限公司,批號20k001)；NADPH再生系統(tǒng)A液、B液[煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸四鈉鹽還原型，北京匯智泰康生物科技有限公司，批號分別為NRS(A)-20L001、NRS(B)-20L001]。人肝微粒體(美國BioIVT Elevating Science公司，Lot#ZZQ)；雄性大鼠肝微粒體(瑞德肝臟疾病研究有限公司，批號JYYJ)。甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨均為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 LC-MS/MS分析

2.1.1 色譜條件 Agilent Extend-C18色譜柱(3.5 μm，2.1 mm×100 mm)；流動相水(含0.5%甲酸、5 mmol/L甲酸銨)(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～4 min，10%B；4～6 min，60%～90%B；6～12 min，90%B；12～15 min，90%～10%B)；體積流量0.3 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；內(nèi)標(biāo)氯霉素(16.24 μg/mL)。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；負(fù)離子模式；一級掃描、多反應(yīng)監(jiān)測方式；毛細(xì)管溫度400 ℃；干燥氣體積流量11 L/min；毛細(xì)管電壓4 000 V；霧化器壓力30 psi(1 psi=0.133 kPa)；松脂醇二葡萄糖苷、內(nèi)標(biāo)檢測離子對分別為m/z681.3～357.1、321.0～152.0，碰撞能量分別為25、20 V。

2.2 肝微粒體體外代謝體系建立和分組 孵育體系總體積為500 μL，包括PBS緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4)、各種屬肝微粒體(含20 mg/mL蛋白)、0.452 0 mg/mL(0.67 μmol/L)松脂醇二葡萄糖苷、輔酶NAPDH再生系統(tǒng)A液和B液(按5∶1比例臨用混合)。在試管(12 mm×75 mm)中將50 μL PBS緩沖液與360 μL超純水混合，加入50 μL冰浴上預(yù)先融化的混合肝微粒體(20 mg/L)、10 μL松脂醇二葡萄糖苷底物溶液，渦旋混勻，在37 ℃下預(yù)孵育5 min，加入30 μL NADPH再生系統(tǒng)啟動反應(yīng)，繼續(xù)在37 ℃下孵育，于0、5、15、30、45、60、90、120 min立即加入1 mL預(yù)冷、含內(nèi)標(biāo)的甲醇終止反應(yīng)，渦旋2 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣檢測。

分別將人和大鼠肝微粒分為3組，依次為實驗組、陰性組、空白組。其中，實驗組為含松脂醇二葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)孵育體系，陰性組孵育體系中不含起始因子NAPDH，而空白組孵育體系中不含松脂醇二葡萄糖，每組3份，平行3次。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取松脂醇二葡萄糖苷對照品適量，置于量瓶中， 流動相溶解并定容至刻度，精密量取1 mL至25 mL量瓶中，流動相定容至刻度，即得。

本文中，提出了一種能夠有效降低細(xì)胞光毒性、動態(tài)追蹤并且精確量化三維細(xì)胞牽引力的3D-TFM方法。該方法將生物相容性的聚丙烯酰胺水凝膠作為細(xì)胞黏附和遷移的基底，然后在凝膠基底的表面修飾單層熒光顆粒作為人造散斑追蹤細(xì)胞的運(yùn)動，采用激光掃描共聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM)延時采集熒光顆粒的三維位置信息，并采用基于二階形函數(shù)的數(shù)字體積相關(guān)技術(shù)計算位移場，根據(jù)基底材料的彈性模量和泊松比以及彈性力學(xué)基本理論[33]，由位移場得到應(yīng)力場。

2.4 線性關(guān)系考察 取不同質(zhì)量濃度松脂醇二葡萄糖苷溶液，加到熱失活的大鼠肝微粒懸浮液中，使反應(yīng)液中底物最終質(zhì)量濃度為0.37、0.75、1.51、3.01、6.02、15.05、30.1 μg/mL，按“2.2”項下方法操作，在“2.1”項條件下進(jìn)樣測定。以松脂醇二葡萄糖苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，松脂醇二葡萄糖苷、內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=0.032 3X-0.017 2(R2=0.999 8)，檢測下限為6.8 ng/mL。

2.5 回收率、精密度試驗 按“2.4”項下方法制備1.35、2.70、5.40 μg/mL底物溶液，在“2.1”項條件下各進(jìn)樣測定6次，測得相對回收率分別為90.5%、92.2%、95.6%，日內(nèi)精密度RSD分別為2.6%、3.5%、3.2%，日間(3 d)精密度RSD分別為5.6%、4.5%、4.2%。

2.6 肝微粒體質(zhì)量濃度對代謝速率的影響 設(shè)置肝微粒體質(zhì)量濃度為0.2、0.5、1、2、5、10、20 mg/mL，松脂醇二葡萄糖苷質(zhì)量濃度為3.01 μg/mL，溫孵時間為120 min，結(jié)果見圖1。由此可知，隨著肝微粒體質(zhì)量濃度增加，底物代謝速率升高，最終確定為20 mg/mL。

圖1 肝微粒體質(zhì)量濃度對代謝速率的影響Fig.1 Effect of liver microsome concentration on metabolic rate

2.7 溫孵時間對松脂醇二葡萄糖苷代謝率的影響 在體外溫孵體系中加入人肝微粒體和SD大鼠肝微粒體，質(zhì)量濃度分別為21.9、20 mg/mL，松松脂醇二葡萄糖在37 ℃下分別孵育0、5、15、30、45、60、90、120 min后檢測其糖苷質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)在90～120 min時趨于穩(wěn)定，最終確定孵育時間為120 min。再以被代謝量和加入量的比值計算松脂醇二葡萄糖苷代謝率，測得在人和SD大鼠肝微粒體中其代謝率分別為9.4%和4.8%，見圖2。

圖2 溫孵時間對松脂醇二葡萄糖苷代謝率的影響Fig.2 Effect of incubation time on the metabolic rate of pinoresinol diglucoside

2.8 質(zhì)譜分析 松脂醇二葡萄糖苷保留時間為4.8 min，在m/z681.3處形成準(zhǔn)分子離子[M-H]-，其二級質(zhì)譜圖見圖3。由此可知，m/z519.3為m/z681.3斷裂1個糖苷鍵形成，而m/z357.3為后者斷裂2個糖苷鍵形成，特征峰強(qiáng)度最高。

圖3 松脂醇二葡萄糖苷二級質(zhì)譜圖Fig.3 Secondary mass spectrum of pinoresinol diglucoside

2.9 人肝微粒體中代謝產(chǎn)物分析 根據(jù)保留時間、分子離子峰、二級質(zhì)譜信息對特征峰進(jìn)行確認(rèn)，初步確認(rèn)松脂醇二葡萄糖在人肝微粒體中生成6個主要代謝產(chǎn)物，分別命名為M1(m/z357.3)、M2(m/z345.4)、M3(m/z331.4)、M4(m/z329.2)、M5(m/z301.4)、M6(m/z297.3)，總離子流圖見圖4。

圖4 松脂醇二葡萄糖苷總離子流圖 Fig.4 Total ion current chromatograms ofpinoresinol diglucoside

M1在保留時間4.8 min處有1個m/z357.3的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-，峰質(zhì)量數(shù)比底物松脂醇二葡萄糖[M-H]-少324 Da，由于該底物包含2個糖苷鍵，故推測m/z357.3可能為底物脫去2個糖基形成；底物離子681.3與M1的主要碎片離子峰相同，均為m/z151.1[M-H-C12H14O3]-，二級質(zhì)譜圖見圖5A。

M2在保留時間6.67 min處有1個m/z345.4的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-，主要碎片離子[M2-H-H2O]-m/z327.3，推測其可能為m/z359.3發(fā)生氧脫甲基反應(yīng)得到；在m/z357.3[M-H]-峰的基礎(chǔ)上加2個氫還原，即1個呋喃環(huán)開環(huán)生成m/z359.3[M-H]-峰，主要碎片離子為m/z257.2、152.3，但它在反應(yīng)液里僅檢測到少量，可能很容易發(fā)生脫甲基反應(yīng)，進(jìn)而生成m/z345.4，二級質(zhì)譜圖見圖5B。

M3在保留時間6.74 min處有1個m/z331.4的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-，它是m/z357.3[M-H]-發(fā)生2個呋喃環(huán)開環(huán)、1個氧脫甲基、1個脫羥基反應(yīng)得到，主要碎片離子m/z313.3[M3-H-H2O]-，二級質(zhì)譜圖見圖5C。

M4在保留時間6.76 min處有1個m/z329.2的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-，是m/z357.3[M-H]-峰發(fā)生2個呋喃環(huán)開環(huán)、脫氫形成內(nèi)酯環(huán)、2次氧脫甲基反應(yīng)而得，主要碎片離子為m/z201.1[M4-110-18-H]-，即m/z201.1[M4-H-C6H6O2-H2O]-，二級質(zhì)譜圖見圖5D。

M5在保留時間6.93 min處有1個m/z301.1的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-，在M1結(jié)構(gòu)上發(fā)生環(huán)氧開環(huán)、2次氧脫甲基、2次脫羥基反應(yīng)，得到m/z301.4[M-H]-峰，碎片離子m/z265.1[M5-H-36]-，即[M5-H-2H2O]-；碎片離子m/z221.0[M5-36-44-H]-，即[M5-2H2O-COOH]-，二級質(zhì)譜圖見圖5E。

M6在保留時間9.79 min處有1個m/z297.3的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-，在1個m/z301.4[M-H]-的基礎(chǔ)上脫去4個氫形成內(nèi)酯環(huán)，得到m/z297.3[M-H]-峰，主要碎片離子m/z250.9[M6-46-H]-，即[M6-HCOOH-H]-，二級質(zhì)譜圖見圖5F。

圖5 松脂醇二葡萄糖苷代謝產(chǎn)物二級質(zhì)譜圖Fig.5 Secondary mass spectra for metabolites of pinoresinol diglucoside

2.10 松脂醇二葡萄糖苷代謝途徑分析

2.10.1 人肝微粒體 見圖6。

注：1為脫糖，2為加氫、脫甲基，3為加氫、脫甲基、脫羥基，4為開環(huán)、脫氫、脫甲基，5為開環(huán)、脫甲基、脫羥基，6為脫氫成環(huán)。圖6 松脂醇二葡萄糖苷在人肝微粒體中的代謝途徑Fig.6 Metabolic pathways of pinoresinol diglucoside in human liver microsomes

2.10.2 大鼠肝微粒體 松脂醇二葡萄糖苷代謝產(chǎn)物有3種，分別為M1、M2、M3，與在人肝微粒中的代謝存在差異。

3 討論與結(jié)論

本實驗建立了靈敏、快速的HPLC-QQQ/MS法來測定人和大鼠肝微粒體中松脂醇二葡萄糖苷及其代謝產(chǎn)物，分別初步確定了6個和3個，均以脫糖基反應(yīng)為主，并且生成的苷元松脂素進(jìn)一步發(fā)生還原、氧脫甲基、開環(huán)等一系列反應(yīng)。通常認(rèn)為，藥物代謝過程可使化合物極性增大，從而促進(jìn)藥物排泄，但也有很多例外[12]，例如在腸道菌群的作用下皂苷會發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，主要是逐步脫糖過程，生成的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物比原皂苷具有更好的生物利用度或更強(qiáng)的生物活性[13]。Kim等[14]發(fā)現(xiàn)，人參皂苷酶促轉(zhuǎn)化只發(fā)生去糖基化；Zhai等[15]報道，黃芪甲苷生物利用度很低，需要在腸道菌群的代謝作用下產(chǎn)生次生皂苷才能大大提高。

本實驗所得結(jié)果與Xie等[10]報道比較，松脂醇二葡萄糖苷在肝微粒體中的代謝產(chǎn)物數(shù)量較少，推測其在肝臟中的專屬代謝酶種類可能少于在腸道菌群中的生物酶，但主要代謝部位尚無法確定。松脂醇二葡萄糖苷屬于木脂素類化合物，在體內(nèi)主要發(fā)生Ⅰ相代謝轉(zhuǎn)化, 即水解、氧化、去甲基化或羥基化等[16]，而且本實驗也只發(fā)現(xiàn)了該類代謝產(chǎn)物，尚未找到II相反應(yīng)相關(guān)產(chǎn)物。

綜上所述，本實驗探討了松脂醇二葡萄糖苷在人和大鼠肝微粒體中的轉(zhuǎn)化規(guī)律，推測了主要轉(zhuǎn)化途徑及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，可為進(jìn)一步研究該成分體內(nèi)代謝過程提供實驗依據(jù)。