林 藝，王 策，康 勛，康 莊，陳 峰，江 波，李文斌

首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院腫瘤綜合治療中心，北京 100070

腦膠質(zhì)瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腦腫瘤之一，約占原發(fā)性腦腫瘤的30%，原發(fā)惡性腦腫瘤的80%［1］。高級別腦膠質(zhì)瘤［世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）Ⅲ～Ⅳ級］惡性程度高、侵襲性強，尤其膠質(zhì)母細胞瘤患者中位總生存期為12～15個月，容易復發(fā)，復發(fā)后患者的中位總生存期為3～6個月［2-3］。因此，膠質(zhì)母細胞瘤復發(fā)是臨床棘手的問題。突破的關(guān)鍵在于深入探究膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展機制，尋找復發(fā)相關(guān)的分子標志物，針對相關(guān)靶點進行轉(zhuǎn)化研究。在神經(jīng)腫瘤領(lǐng)域，基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）和中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）數(shù)據(jù)庫已經(jīng)實現(xiàn)數(shù)據(jù)公開，為膠質(zhì)瘤相關(guān)的標志物研究提供了新的途徑［4-5］。本研究通過對GEO、癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和CGGA等公共數(shù)據(jù)庫進行挖掘，篩選膠質(zhì)母細胞瘤復發(fā)相關(guān)基因，并分析表達、臨床病理學參數(shù)及臨床預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 膠質(zhì)母細胞瘤相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)來源

基因芯片數(shù)據(jù)來源于GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫，檢索策略為Recurrent［All Fields］AND (Glioblastoma［MeSH Terms］OR Glioblastoma［All Fields］）。研究納入標準為采用手術(shù)切除樣本（原發(fā)腫瘤和復發(fā)腫瘤均大于10例）進行RNA檢測的數(shù)據(jù)集，排除標準為采用細胞培養(yǎng)或動物模型（Xenograft）等處理過的樣本研究。數(shù)據(jù)集GSE62153和GSE58399符合研究標準，包含膠質(zhì)母細胞瘤和復發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤患者組織標本的樣本，表達數(shù)據(jù)和實驗平臺等信息見表1。研究通過R軟件，下載了標準化的表達數(shù)據(jù)，利用Biobase、GEOquery和limma等數(shù)據(jù)包，尋找膠質(zhì)母細胞瘤復發(fā)相關(guān)的差異表達基因（differentially expressed gene，DEG），并以P＜0.05，logFC＞1或logFC＜-1作為篩選條件進行后續(xù)分析。

表1 研究入選GEO數(shù)據(jù)集合信息Tab.1 Information about the GEO data and series

1.2 生物信息相關(guān)分析

基因功能及通路分析：利用R工具“org.Hs.eg.db”“clusterProfiler”“enrichplot”對DEG進行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號富集分析。GO分析包括生物過程（biological process）、細胞組成（cellular component）和分子功能（molecular function）3個部分。利用STRING工具構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，尋找蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。Hub基因的篩選通過PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape中的“Hub”計算生成。生存分析、表達分析使用GEPIA和CGGA數(shù)據(jù)庫相關(guān)在線Survival分析工具。STRING、GEPIA和CGGA數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址見表2。

表2 生物信息相關(guān)在線分析工具Tab.2 Databases related to bioinformatics analysis

1.3 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用R4.0.2軟件進行統(tǒng)計分析，使用limma數(shù)據(jù)包中的Studentt檢驗方法篩選DEG。在GO通路分析中，數(shù)據(jù)間差異比較采用ANOVA檢驗。KEGG中選擇差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）的信號轉(zhuǎn)導通路進行研究。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。癌組織和癌旁組織表達量差異采用配對t檢驗用來比較，χ2檢驗比較臨床病理學參數(shù)組間差異（n＜5時行連續(xù)校正χ2檢驗）。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)母細胞瘤復發(fā)相關(guān)基因的生物信息學篩選和富集分析

GSE62153數(shù)據(jù)集納入病例43例，包括25例原發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤和18例復發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤病例。GSE58399數(shù)據(jù)集納入病例105例，包括72例原發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤和33例復發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤。GSE62153數(shù)據(jù)集篩選到40個DEG，上調(diào)基因34個，下調(diào)基因6個。GSE58399數(shù)據(jù)集篩選到19個DEG，上調(diào)基因16個，下調(diào)基因3個。GO功能分析結(jié)果提示GSE62153的DEG主要參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、髓鞘、肌動蛋白結(jié)合及中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成等11個生理過程（表3）。而GSE58399的DEG主要參與上皮細胞遷移的正調(diào)控（表4）。KEGG信號轉(zhuǎn)導通路富集分析結(jié)果顯示，GSE62153和GSE58399的DEG存在共同富集—組氨酸代謝（圖1，表4）。

圖1 GSE62153數(shù)據(jù)集KEGG信號轉(zhuǎn)導通路富集Fig.1 Enrichment of KEGG signaling pathway in GSE62153 dataset

表3 GSE62153 GO功能分析結(jié)果Tab.3 GSE62153 GO function analysis

表4 GSE58399 GO功能及KEGG信號轉(zhuǎn)導通路富集分析結(jié)果Tab.4 GSE58399 GO function and KEGG signal pathway enrichment analysis

2.2 膠質(zhì)母細胞瘤復發(fā)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及Hub基因挖掘

PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建基于GSE62153和GSE58399篩選出來的DEG，通過STRING數(shù)據(jù)庫，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，共有20個蛋白分子構(gòu)建成為核心相互作用網(wǎng)絡(luò)，相關(guān)基因為MOG、ASPA、ERMN、PTGDS、MOBP、CLDN11、NKX6-2、CNDP1、SH3GL2、OPALIN、KLK6、MYBPC1、SH3G L3、P LP1、TME M125、AK R1C3、CARNS1、HLA-DPA1、HHATL和SEPP1基因（圖2）。而后利用Cytscape軟件對構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)進行分析和Hub基因挖掘，結(jié)果篩選出10個Hub基因，分別為MOBP、OPALIN、ERMN、PLP1、MOG、CLDN11、ASPA、TMEM125、KLK6和NKX6-2基因（圖3）。為進一步獲得膠質(zhì)母細胞瘤復發(fā)的關(guān)鍵核心基因，通過Venn圖工具取出GSE62153和GSE58399芯片的DEG的交集，結(jié)果提示共有6個DEG（圖4）。最后再選擇排名前5的Hub基因與GSE62153和GSE58399篩選出來的DEG取交集，結(jié)果提示共有3個基因，分別為ERMN、MOG和MOBP基因。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network

圖3 Hub基因篩選圖Fig.3 Bioinformatics screening of Hub gene

圖4 DEG與Hub基因韋恩圖Fig.4 Venn diagram of DEG and Hub gene

2.3 ERMN、MOG和MOBP基因mRNA的表達水平與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系

為分析ERMN、MOG和MOBP基因在膠質(zhì)瘤中的預(yù)后價值，研究通過GEPIA進行生存分析，Kaplan-Meier法結(jié)果顯示，在TCGA數(shù)據(jù)庫676例膠質(zhì)瘤病例中，ERMN、MOG和MOBP基因高表達者預(yù)后均優(yōu)于低表達組，總生存率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖5）。為進一步驗證該生存分析結(jié)果，研究進一步利用CGGA mRNA芯片數(shù)據(jù)庫進行生存分析，結(jié)果顯示，ERMN、MOG和MOBP基因與膠質(zhì)瘤患者的總生存率均顯著相關(guān)（P＜0.000 1，圖5），ERMN、MOG和MOBP基因高表達組預(yù)后優(yōu)于低表達組。

圖5 基于TCGA和CGGA膠質(zhì)瘤病例的生存分析Fig.5 Survival analysis of TCGA and CGGA database

2.4 ERMN、MOG和MOBP基因mRNA在膠質(zhì)瘤組織中的表達

通過GEPIA分析ERMN、MOG和MOBP基因在膠質(zhì)瘤中的表達情況。ERMN、MOG和MOBP基因在低級別膠質(zhì)瘤和對照組織之間的表達水平差異無統(tǒng)計學意義，而在膠質(zhì)母細胞瘤和對照組織之間差異有統(tǒng)計學意義（圖6）。ERMN、MOG和MOBP基因在膠質(zhì)母細胞瘤組織內(nèi)的表達水平低于對照組織。研究進一步通過CGGA數(shù)據(jù)庫分析ERMN、MOG和MOBP基因在腫瘤不同分級（WHOⅡ、Ⅲ和Ⅳ級）組織間的表達情況，結(jié)果顯示，ERMN、MOG和MOBP基因在不同分級組織內(nèi)的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），且隨著膠質(zhì)母細胞瘤的級別升高，ERMN、MOG和MOBP基因的表達逐漸降低（圖6）。

2.5 ERMN、MOG和MOBP基因mRNA表達水平與膠質(zhì)瘤臨床病理學參數(shù)的關(guān)系

通過提取CGGA數(shù)據(jù)庫的臨床數(shù)據(jù)和表達譜數(shù)據(jù)，進一步分析ERMN、MOG和MOBP基因的表達情況與膠質(zhì)瘤臨床病理學參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果顯示，ERMN、MOG和MOBP基因的表達與WHO分級、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）狀態(tài)和臨床病理學參數(shù)相關(guān)（P＜0.001，表5）。MOBP基因的表達與患者年齡（P＜0.001）和MGMT基因甲基化狀態(tài)相關(guān)（P=0.022，表5）。

表5 ERMN、MOG和MOBP基因mRNA的表達水平與膠質(zhì)瘤臨床病理學參數(shù)的關(guān)系Tab.5 Association between ERMN,MOG and MOBP genes expressions and the patient's clinicopathological characteristics in patients with glioma（n）

3 討 論

膠質(zhì)瘤是一類原發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常見惡性腫瘤。盡管在過去的幾十年中，其治療已有很大進展，但是大多數(shù)患者的臨床結(jié)局仍然很差。Nieder等［6］報道惡性膠質(zhì)瘤患者復發(fā)后生存時間為6～8個月，而出現(xiàn)第2次進展患者的中位生存期僅為14周。膠質(zhì)母細胞瘤患者總體預(yù)后差，即使接受手術(shù)聯(lián)合放療和替莫唑胺化療標準治療方案治療，復發(fā)率和死亡率仍較高。Stupp方案延長了膠質(zhì)母細胞瘤患者的總生存期和無進展生存期，但總生存期不足15個月，而5年生存率也低于10%［7］。

文獻［8］報道，復發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤患者接受挽救療法［化療和（或）再次放療］的中位生存期為5.3個月。一項納入167例復發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤患者的Ⅱ期臨床試驗［9］，將患者隨機分入貝伐珠單抗單藥治療和聯(lián)用伊立替康組，總生存期分別為9.2和8.7個月。一項病例系列研究［10］顯示，Ⅳ級患者接受立體定向放療（stereotactic radiosurgery，SRS）后的中位無進展生存期為4.6個月。復發(fā)膠質(zhì)母細胞患者應(yīng)用貝伐珠單抗聯(lián)合SRS（n=20），患者的6個月無進展生存率達65%［11］。2006—2009年一項復發(fā)膠母細胞瘤Ⅲ期臨床試驗［12］將237例復發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤患者按l∶1隨機分配接受單純電場療法治療組（n=120）或最優(yōu)化療組（n=117），結(jié)果顯示，腫瘤治療電場組與最優(yōu)化療組的中位總生存期分別為6.6和6.0個月（P=0.27），中位無進展生存期分別為2.2和2.1個月（P=0.16）。復發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤尚無標準治療方案，美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南推薦考慮臨床試驗。

膠質(zhì)母細胞瘤具有高度異質(zhì)性，其進化過程表現(xiàn)出高度分支化特征，按照分支模式及進化速率的估算，與復發(fā)相關(guān)的克隆往往在診斷前已存在。接受替莫唑胺治療的膠質(zhì)母細胞瘤患者中有17%（17/100）復發(fā)并伴有高突變腫瘤，但未接受替莫唑胺治療的患者中沒有發(fā)生高突變［13］。Nandeesh等［14］研究表明，復發(fā)性腫瘤中SOX2表達的顯著增加可能表明這些腫瘤中存在具有干樣特性的未分化細胞，這種改變可能增加的侵襲性和干性，抵抗放療和化療。Zhang等［15］將23例患者切除的標本進行了外顯子組測序，該組病例均為初始低級別膠質(zhì)瘤，而后出現(xiàn)復發(fā)性腫瘤，在43%的病例中，至少有一半的初始腫瘤突變在復發(fā)時未被發(fā)現(xiàn)，包括TP53、ATRX、SMARCA4和BRAF中的驅(qū)動突變，10例接受替莫唑胺治療的患者中有6例腫瘤發(fā)展為高級別膠質(zhì)瘤，復發(fā)腫瘤發(fā)生超突變，并帶有TMZ誘導突變特征，即視網(wǎng)膜母細胞瘤（retinoblastoma，RB）和蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian targets of rapamycin，mTOR）的驅(qū)動突變［15］。Kim等［16］通過采用多基因組學方法分析初次和再次手術(shù)的26對配對腦膠質(zhì)瘤標本，證實復發(fā)膠質(zhì)瘤獲得了大量新的基因突變。膠質(zhì)母細胞瘤復發(fā)的兩種腫瘤進化途徑：大多數(shù)局部復發(fā)的腫瘤共有大多數(shù)初始腫瘤突變，與線性進化一致。在遠處復發(fā)時，初始和復發(fā)腫瘤之間的遺傳差異導致關(guān)鍵膠質(zhì)母細胞瘤驅(qū)動基因/途徑改變的變化。本研究所選用兩個數(shù)據(jù)集分析產(chǎn)生的DEG交集并不多，這可能是因為膠質(zhì)母細胞瘤復發(fā)后驅(qū)動復發(fā)增長的基因改變較多，與初始腫瘤不同。

本研究篩選出了膠質(zhì)母細胞瘤復發(fā)相關(guān)的關(guān)鍵基因3個，即ERMN、MOG和MOBP基因。ERMN是參與髓鞘形成過程的必需基因，而少突膠質(zhì)細胞主要是形成髓磷脂的細胞，是葉酸代謝中斷的主要靶標［17-19］。在少突膠質(zhì)細胞成熟過程中，髓鞘特異性蛋白，如蛋白脂蛋白（protein lipoprotein，PLP）和髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）在少突膠質(zhì)細胞中依次表達。MOG則是一種表達在髓鞘和少突膠質(zhì)細胞膜的表面糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。MOG最先由Linnington等［20］于1984年利用小鼠單抗確定并命名，其特異性表達在少突膠質(zhì)細胞和髓鞘表面的I型膜結(jié)合糖蛋白位于髓鞘結(jié)構(gòu)的最外層［21］。在脫髓鞘病變的急性、亞急性及緩解期，MOG抗體均可出現(xiàn)［22］。MOBP是構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂的第三大蛋白質(zhì)。像髓磷脂堿性蛋白一樣，MOBP主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂的致密線，提示在髓磷脂的緊實或穩(wěn)定中起作用。

通過本次生物信息學分析，我們進一步發(fā)現(xiàn)GSE62153和GSE58399的DEG KEGG通路富集分析結(jié)果存在交集—組氨酸代謝［23］。組氨酸代謝途徑可調(diào)節(jié)甲氨蝶呤藥物敏感性，提示甲氨蝶呤鞘內(nèi)注射化療對復發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤的治療價值可能源自于組氨酸代謝。甲氨蝶呤是目前臨床廣泛應(yīng)用的抗腫瘤化療藥物，主要適用于白血病和某些其他類型的實體腫瘤，特別是原發(fā)性中樞神經(jīng)淋巴瘤。大劑量甲氨蝶呤是原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的首選治療方案。Ommaya囊作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的常用輔助裝置，臨床常用于腦室內(nèi)引流與給藥，尤其顱內(nèi)感染和顱內(nèi)腫瘤的局部用藥。1976年Romodanov等［24］對52例惡性腦腫瘤患者進行甲氨蝶呤鞘內(nèi)注射能夠讓腫瘤縮小，病理形態(tài)學分析提示，其對惡性腦腫瘤具有明顯的破壞作用。1991年Nierenberg等［25］對5例多形性膠質(zhì)母細胞瘤患者給予甲氨蝶呤治療，尸檢發(fā)現(xiàn)甲氨蝶呤治療患者腫瘤組織出現(xiàn)液化性壞死。李豐展等［26］分析了甲氨蝶呤經(jīng)Ommaya 鞘內(nèi)注射間質(zhì)化療聯(lián)合同步放化療膠質(zhì)母細胞瘤患者，發(fā)現(xiàn)其復發(fā)時間為（13.61±3.83）個月，中位生存時間為2.10個月（1.35～2.70個月），優(yōu)于常規(guī)放化療的（10.31±2.20）個月和1.55個月（1.30～2.10個月）。我們團隊前期基礎(chǔ)研究［27］結(jié)果顯示，甲氨蝶呤通過下調(diào)RAS/MAPK/MYC/CD47信號轉(zhuǎn)導通路，抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87生長。甲氨蝶呤鞘內(nèi)注射治療復發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤患者在臨床應(yīng)用中取得了一定的效果，未來應(yīng)進一步深入研究其具體機制。

綜上所述，生物信息學分析結(jié)果表明，ERMN、MOG和MOBP基因的表達改變與膠質(zhì)瘤的臨床病理學參數(shù)及患者預(yù)后有關(guān)，有可能成為甄別復發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤的標志物。本研究所利用的開放數(shù)據(jù)庫病例涵蓋東、西方膠質(zhì)瘤人群，預(yù)后分析結(jié)果顯示，東西方人群的基因類型并沒有顯著差異。ERMN、MOG和MOBP基因的預(yù)后預(yù)測價值還需要進一步利用中國的病例樣本在蛋白水平進行驗證，以期尋找到診療標志物，并對其功能和機制進行研究，為膠質(zhì)瘤的復發(fā)診斷、預(yù)后預(yù)測提供線索和依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。