張 倩，任 敏，茍 妍，陶金忠

（寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

0 引言

應(yīng)激（Stress）這一觀點(diǎn)最先是由加拿大的病理生理學(xué)家Hans Selye于1936年在《Nature》雜志上首次提出的。其基本定義被認(rèn)為泛指機(jī)體在遭遇內(nèi)外部刺激性因子的相互刺激下，所觸發(fā)的一系列非特異性生理防御機(jī)制，其中，下丘腦垂體腎上腺的激活過程是整個反應(yīng)過程中最主要的一種[1-3]。下丘腦垂體中的腎上腺軸突的活動直接受到位于下丘腦垂體中心室旁核（paraventricular hypothalamicnucleus，pvn）活動的影響。當(dāng)機(jī)體大腦受到強(qiáng)烈刺激時，室旁核神經(jīng)細(xì)胞分泌精氨酸加壓素（avon）和促腎上腺皮質(zhì)激素，從而使垂體產(chǎn)生和分泌促腎上腺皮質(zhì)激素（Adreno-cortico-tropic-hormone，ACTH）。促腎上腺皮質(zhì)激素隨著血液流動到達(dá)腎上腺，刺激腎上腺皮質(zhì)合成和分泌皮質(zhì)醇[5-7]。隨后，ACTH刺激腎上腺皮質(zhì)釋放皮質(zhì)醇，而皮質(zhì)醇反過來又向垂體提供負(fù)反饋，減少促腎上腺皮質(zhì)激素的分泌，皮質(zhì)醇是腎上腺在面臨壓力時產(chǎn)生的一種糖皮質(zhì)激素，具備抑菌、抗炎、抗過敏、抗病毒等的作用，可顯著的增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性[8]。正常情況下，機(jī)體通過控制皮質(zhì)醇分泌和調(diào)節(jié)血液中皮質(zhì)醇的含量來保持正常的生理功能。在應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)源性皮質(zhì)醇產(chǎn)生量激增（至正常程度的10倍上下)來抵擋刺激，并產(chǎn)生針對性的應(yīng)激反應(yīng)。血液中的皮質(zhì)醇濃度是權(quán)衡激素強(qiáng)度的一個指標(biāo)。生產(chǎn)實(shí)踐中，常用測量血液中乳糖皮質(zhì)醇的平均含量值來評定奶牛的應(yīng)激和其他疾病狀態(tài)，但其濃度可能會同時受到血液采樣和應(yīng)激等因素的嚴(yán)重干擾[9-10]。

近年來，隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，應(yīng)激的防治成為獸醫(yī)臨床關(guān)注的重點(diǎn)。大量研究表明，動物應(yīng)激受生理性因素、環(huán)境性因素、管理性因素以及藥物性因素的影響。長途運(yùn)輸后肉牛會出現(xiàn)運(yùn)輸應(yīng)激綜合征導(dǎo)致應(yīng)激激素水平增加，也可能減少蛋白質(zhì)的合成，降低生產(chǎn)性能和泌乳能力[11-13]。流行病學(xué)研究顯示，應(yīng)激刺激嚴(yán)重者可以使蛋雞產(chǎn)蛋率從85%驟降到15%；德國每年由于運(yùn)輸應(yīng)激而死亡的屠宰肉豬比例大約是0.2%；美國因運(yùn)輸應(yīng)激而死亡的豬比例也很高，每年將近損失3 000萬美元?？梢?，應(yīng)激嚴(yán)重危害動物的健康。已成為亟待解決的問題之一。

在動物實(shí)驗(yàn)中，單欄飼喂是經(jīng)常使用的一種飼養(yǎng)方式。單欄飼喂，雖便于飼喂管理，但限制了動物的活動及生存空間，是否會對動物產(chǎn)生應(yīng)激，目前尚不清楚。本試驗(yàn)通過比較單欄飼喂和圈舍喂養(yǎng)兩種不同飼喂方式對灘羊應(yīng)激激素水平的變化，探究單欄飼喂對灘羊應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

常用儀器與試劑，見表1。

1.2 試驗(yàn)動物與分組

本試驗(yàn)于2019年8—9月份從寧夏鹽池灘羊育種場選取24只健康無病、月齡相近的灘羊，并隨機(jī)將其分為2組（實(shí)驗(yàn)組與對照組），每組各12只，2組灘羊均飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組進(jìn)行單欄飼喂，對照組進(jìn)行圈舍飼喂。分別于第1 d、第14 d和第24 d晨飼前采集試驗(yàn)灘羊頸靜脈血樣10 mL，加入肝素鈉抗凝，在3 000 rpm條件下離心15 min后獲得血漿，置于-20℃冰箱中冷凍保存待檢。

1.3 樣本預(yù)處理

從-20℃冰箱中取出血樣，緩慢解凍后至常溫，使用ELISA試劑盒檢測第1 d、第14 d和第24 d血漿樣品中皮質(zhì)醇和ACTH含量。

1.4 ELISA檢測

1）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和樣品的添加:在酶標(biāo)包被板上分別依序設(shè)置1個符合標(biāo)準(zhǔn)的乳化樣品10孔，在第1和第2孔中分別依次稀釋加入1個符合標(biāo)準(zhǔn)的乳化樣品100μL，并且在第1和第2孔中分別依次加入2個標(biāo)準(zhǔn)新產(chǎn)品稀釋液50μL依次混勻，然后從第1孔和第2孔中各取100μL分別依次加入混勻到第3孔和第4孔中，接著在第3孔和第4孔分別依次加2個標(biāo)準(zhǔn)品稀液50μL，混勻，然后再從第3孔和第4孔中分別取50μL混勻棄掉，再各取50μL分別依次加到第5和第6孔中，再在第5和第6孔中依次加入2個標(biāo)準(zhǔn)新產(chǎn)品稀釋液50μL，混勻，混勻后從第5孔和第6孔中分別取50μL依次加到第7孔和第8孔中，再從第7孔和第8孔中分別依次加2個標(biāo)準(zhǔn)新產(chǎn)品稀釋液50μL，混勻后再從第7孔和第8孔中分別取50μL依次加到第9孔和第10孔中，再從第9孔和第10孔分別依次加入2個標(biāo)準(zhǔn)新產(chǎn)品稀釋液50μL，混勻后從第9孔和第10孔中分別取50μL別棄掉。（使用皮質(zhì)酸乙醇溶液稀釋后各孔徑添加樣物含量都為50μL，質(zhì)量濃度分別為300、200、100、50、2.5μg/L；ACTH（稀釋后各孔徑添加樣物含量都為50μl，質(zhì)量濃度分別為90、30、15、7.5 ng/L）。

2）加樣:分別設(shè)空缺孔（即在空缺對照板的孔隙內(nèi)不加待測樣品及其他酶標(biāo)待測試劑，別的各步加樣操縱并無差異)、待檢預(yù)測酶標(biāo)樣品孔，在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加空缺待檢預(yù)測酶標(biāo)樣品10μL（待測樣品最后的稀釋度為5倍），將待測樣品試劑加于原酶標(biāo)板孔底部，（盡量不直接碰觸孔壁，輕輕左右搖晃使其混勻）。

3）溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30 min。

4）配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

5）洗滌:注意要仔細(xì)揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，同上步驟反復(fù)5次，拍干。

6）加酶:每孔選項(xiàng)加入帶有酶標(biāo)記的試劑50μL，空白孔選項(xiàng)除外。

7）溫育:操作同3。

8）洗滌:操作同5。

9）顯色:每孔先加入顯色劑B50μL，輕輕搖晃使之均勻混合，37℃避光顯色15 min。

10）反應(yīng)終止:每孔中添加一次終止液50μL之后該孔停止化學(xué)反應(yīng)（此時孔由藍(lán)色逐漸變?yōu)榻瘘S色）。

11）測定:以空缺孔調(diào)零，420 nm波長依序丈量各孔的吸光度（OD值），測定應(yīng)在加停止液之后15 min之內(nèi)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

首先通過Excel對測量數(shù)據(jù)進(jìn)行排序后，采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)顯著性分析，所得的數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著性水平為（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

ACTH標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=46.435X+2.313 5，R2=0.984 8；皮質(zhì)醇標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=188.54X+1.998，R2=0.987 7。說明兩個曲線擬合良好。式中:X為溶液濃度，Y為吸光度。

2.2 對照組與試驗(yàn)組皮質(zhì)醇與ACTH濃度變化

由表2可知，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，皮質(zhì)醇濃度隨時間的變化而呈下降趨勢，且在3個時間點(diǎn)對照組與試驗(yàn)組之間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 皮質(zhì)醇濃度隨時間變化情況

由表3可知，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，ACTH濃度隨時間的變化各組ACTH呈上升趨勢，在第24 d時，對照組ACTH濃度極顯著高于試驗(yàn)組（P＜0.01）。

表3 ACTH濃度隨時間變化情況

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，動物在急性應(yīng)激下，皮質(zhì)醇激增。雖然最開始是在促腎上腺皮質(zhì)激素水平大幅上升之前皮質(zhì)醇才開始升高，但如果出現(xiàn)長期的炎癥應(yīng)激，促腎上腺皮質(zhì)激素的水平會恢復(fù)到相近于基礎(chǔ)水平，而皮質(zhì)醇水平則由于腎上腺敏感性的增加而持續(xù)上升；在慢性應(yīng)激狀態(tài)下，垂體的下丘腦激活由促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素為主轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼岷笕~加壓素為主，皮質(zhì)醇水平持續(xù)升高，至少部分原因是皮質(zhì)醇代謝下降[14-15]。

大鼠在恐懼應(yīng)激條件下其血漿中ACTH和皮質(zhì)醇在血清中的含量明顯高于常規(guī)，ACTH和皮質(zhì)醇的含量可以反映垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的功效轉(zhuǎn)變[16]。另有研究表明，當(dāng)奶牛患有子宮內(nèi)膜炎等疾病時，毛發(fā)中皮質(zhì)醇濃度會升高，而當(dāng)奶牛處于亞臨床疾病狀態(tài)時，毛發(fā)中皮質(zhì)醇含量沒有明顯升高[17-21]。在國內(nèi)，每年有超過5 000萬頭牛通過半掛車被運(yùn)輸，有研究表明，當(dāng)奶牛在運(yùn)輸壓力下，血清中的ACTH和皮質(zhì)醇含量都會上升。當(dāng)奶牛處于急性熱應(yīng)激時，血清皮質(zhì)醇的含量也會升高，說明在應(yīng)激刺激下，機(jī)體作為回應(yīng)，其應(yīng)激素ACTH和皮質(zhì)醇會升高。

皮質(zhì)醇用作評估動物壓力程度的指標(biāo)，其具有支持或調(diào)控機(jī)體代謝、免疫及穩(wěn)態(tài)的功能，各種生理或病理因素會影響血漿皮質(zhì)醇激素含量的變化。宋鵬康等人[22]研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠前、中、后期，與自由產(chǎn)圈的相比，限位欄產(chǎn)圈下母豬皮質(zhì)醇含量有一定程度的增加但差異不顯著。本試驗(yàn)結(jié)果表明，單欄飼喂與圈舍飼養(yǎng)下2組灘羊血漿皮質(zhì)醇激素水平差異不顯著。這與宋鵬康[22]等人的研究結(jié)果基本相一致。說明單欄飼喂雖然限定了羊只自由活動，但不影響灘羊皮質(zhì)醇的分泌。上述試驗(yàn)經(jīng)由神經(jīng)內(nèi)分泌和血液生理指標(biāo)的轉(zhuǎn)變，提高人體適應(yīng)環(huán)境轉(zhuǎn)變的本領(lǐng)，從而保證生命活動的正常進(jìn)行。在單欄飼喂第24 d的灘羊ACTH濃度低于對照組，說明在單欄飼喂的過程中，皮質(zhì)醇和ACTH兩種應(yīng)激激素的分泌并未受到顯著影響，推斷單欄飼喂不對灘羊產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)或受到的應(yīng)激反應(yīng)很小。