山 丹，時青云

(首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 北京婦幼保健院產(chǎn)科，北京 100026)

小于胎齡兒(small for gestation age,SGA)是指出生體重在相同胎齡兒平均體重的第10個百分位以下，或胎齡滿37孕周出生體質量低于2500g的嬰兒。流行病學調查數(shù)據(jù)顯示，全球新生兒的SGA發(fā)生率為2.3%～10.0%，中國為3.4%～9.0%[1]。胎齡較小不僅增加新生兒的死亡風險，而且胎齡較小的嬰兒神經(jīng)發(fā)育遲緩、成年后肥胖的風險也高于正常嬰兒。研究報道，SGA下丘腦神經(jīng)發(fā)育調控異常，導致異常的食欲/生理飽足感和細胞信號反應，出現(xiàn)青春期體重快速追趕以及成年后肥胖[2]。此外，SGA在學齡期的認知能力、注意力集中能力、運動協(xié)調能力、記憶功能以及反應靈敏度等方面的表現(xiàn)均低于正常胎齡出生的兒童[3-4]。有研究證明，SGA因在宮內處于營養(yǎng)不良環(huán)境，發(fā)育潛力受限，對下丘腦神經(jīng)前體細胞(neural precursor cells，NPCs)的增殖分化產(chǎn)生不利影響，具體表現(xiàn)為增殖減少，優(yōu)先分化為星形膠質細胞[5]。

SIRT1(silent mating type information regulation 1)屬于依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的Ⅲ類組蛋白脫乙?；福赏ㄟ^乙?；{控多種轉錄因子，具有一定的神經(jīng)保護作用[6]。SIRT1作為“細胞能量傳感器”參與體內多種生理功能的調節(jié)，包括胚胎時期的神經(jīng)發(fā)生[7-8]。大部分SGA的發(fā)生是由胎盤功能不全導致，存在缺氧，因此SGA在宮內長期處于氧化應激狀態(tài)。在SGA下丘腦中，氧化應激可通過調節(jié)SIRT1的高表達，促使NPCs向星形膠質細胞分化[9]。DNA甲基化是主要的表觀遺傳機制之一，能夠調節(jié)NPCs的細胞命運并控制神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞的順序生成[10]。DNA甲基化也是星形膠質細胞分化的內在關鍵決定性因素，經(jīng)典星形膠質細胞標記物(GFAP)啟動子的甲基化與GFAP的活性表達以及星形膠質細胞的生成呈負相關[11-12]。TET甲基胞嘧啶雙加氧酶2(TET2)作為DNA去甲基化過程中的關鍵酶，能夠改變DNA甲基化狀態(tài)，從而觸發(fā)被動的DNA去甲基化[13]。研究證明，TET2在星形膠質細胞中高度表達，通過對星形膠質譜系基因的去甲基化作用，促使神經(jīng)前體細胞分化趨勢由神經(jīng)元轉換為星形膠質細胞[14]。SIRT1與DNA甲基化密切相關，TET2的活性表達受SIRT1調控[15]。Sun等[16]運用RNA篩選和蛋白質組學分析表明，SIRT1使骨髓增生異常綜合征中干細胞的TET2催化域中保守的賴氨酸殘基處脫乙酰，增強了TET2的活性。鑒于SIRT1與TET2均對神經(jīng)前體細胞的分化產(chǎn)生影響，且SIRT1對TET2的活性具有調控作用，因此，推測在SGA下丘腦中，SIRT1可能通過影響TET2的活性來調節(jié)星形膠質細胞活化標記物(GFAP)啟動子區(qū)域的甲基化水平，從而介導SGA下丘腦神經(jīng)前體細胞向星形膠質細胞的分化,促進星形膠質細胞的生成。本研究通過構建SGA動物模型，采用體外細胞培養(yǎng)的方法，探討SIRT1和TET2在NPCs向星形膠質細胞分化過程中的調控關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD孕鼠：購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，本研究已通過倫理審查，得到北京首都醫(yī)科大學動物研究委員會的批準(倫理編號：AEEI-2019-111)，并按國家批準的實驗室動物保護和使用機構指南進行。

1.2 主要試劑和材料 Neurobasal培養(yǎng)基、B27(50x)、肝素熒光素偶聯(lián)物購自美國Thermo公司，GFAP抗體(GTX34756)和Tuj1抗體(GTX130245)(美國GeneTex公司)，TET2多克隆抗體(BS7804)(美國bioworld公司)，SIRT1抗體(DF6033)和Nestin抗體(DF7754)(Affinity公司)，SIRT1抑制劑(sirtinol)(ab141263)購自英國Abcam公司，SIRT1激活劑白藜蘆醇(ST1623)(上海碧云天生物技術有限公司)，大鼠表皮生長因子(美國Peprotech公司)，逆轉錄試劑盒和RT-PCR熒光定量試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，甲基化特異性PCR試劑盒和DNA重亞硫酸鹽轉化試劑盒購自天根公司，辣酸根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(bs-0295G-HRP)(北京博奧森生物技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 構建SGA大鼠模型 將12只無特定病原體級(specific pathogen free,SPF)的SD(Sprague-Dawley)孕鼠隨機分為SGA組和對照組,各6只，體質量約200～300g，日齡90～120d,在室溫(18～25℃)、相對濕度為60%～70%的無菌屏障系統(tǒng)內飼養(yǎng)。對照組給予繁殖飼料喂養(yǎng)，妊娠期間不限制飼料和飲水；SGA組給予8%低蛋白飼料喂養(yǎng)，自孕10天起，給予50%限制飲食(依據(jù)對照組前一天的正常平均飲食量)。

1.3.2 分離培養(yǎng)神經(jīng)前體細胞 分別在SGA組和對照組每只孕鼠生產(chǎn)的幼崽中隨機取4只子代鼠(均為雄性)，腹腔注射10%水合氯醛,按0.5mL/100g劑量處死，無菌條件下分離各組子代鼠腦組織，將大腦轉移至DMEM/F12培養(yǎng)基中，分離下丘腦。將分離好的下丘腦組織剪碎，用0.1%胰蛋白酶-EDTA在37℃的CO2培養(yǎng)箱中分解5min，用10%FBS溶液清洗，使胰蛋白酶失活，將分解后的細胞過濾,1000r/min離心5min，棄上清,置完全培養(yǎng)基(CM，5×104/mL，由Neurobasal培養(yǎng)基、1% 抗體、2% B27、20ng/mL FGF2、20ng/mL EGF、1μg/mL肝素和2.5μg/mL的L-谷氨酰胺配制而成)中，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～9天，每三天更換一次培養(yǎng)基，收集P0代神經(jīng)球，相同過程再培養(yǎng)8～9天后，收集P1代細胞。各組P1代細胞解離后重懸于分化培養(yǎng)基(DM，不加FGF2、EGF、肝素)，隨機分為3組:第一組加入SIRT1抑制劑(sirtinol);第二組加入SIRT1激活劑(白藜蘆醇);第三組為空白對照組，培養(yǎng)8～9天后收集細胞進行檢測。

1.3.3 QT-PCR檢測SGA大鼠下丘腦神經(jīng)前體細胞中SIRT1、TET2、GFAP的mRNA表達 采用Trizol法提取樣本總RNA，根據(jù)逆轉錄試劑盒說明書將總RNA逆轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行逆轉錄聚合酶鏈反應擴增。引物序列：SIRT1上游為5'-TGAGAGAAGTCAGCATCGCATTG-3'，下游為5'-ATGGAGGCTCACAGTGATAGG-3'；TET2上游為5'-GGAGGAGAAGAGTCAGGAGGTTAGTG-3'，下游為5'-CCGAAGTTGTGCTGTCATCTGTATCA-3'；GFAP上游為5'-TGAGGAAGATCCATGAGGAGGAAGTT-3'，下游為5'-AGTTGGCGGCGATAGTCATTAGC-3'；GAPDH上游為5'-GGCAAGTTCAACGGCACAG-3'，下游為5'-CGCCAGTAGACTCCACGACA-3'。反應條件：95℃變性10s，60℃退火20s，72℃延伸20s，40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法進行定量分析，計算SIRT1、TET2、GFAP的相對表達量。

1.3.4 Western blot法檢測SIRT1、TET2、GFAP蛋白表達 收集各組細胞，提取細胞總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度，按10μL/孔的上樣量進行SDS-PAGE電泳分離，轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗4℃過夜孵育，TBST充分洗滌，加相應HRP標記二抗，室溫孵育1h，加化學發(fā)光劑，用全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進行曝光，以GAPDH為內參，用Image J軟件分析灰度值。

1.3.5 免疫熒光測定下丘腦神經(jīng)前體細胞中Tuj1/GFAP比例 將下丘腦組織用石蠟包埋，切片，用二甲基苯脫蠟兩次，每次10min，通過梯度滲透洗脫酒精；組織切片置于3%過氧化氫溶液中浸泡15min，PBS洗滌，檸檬酸鈉溶液進行抗原回收;用PBS溶液洗滌3次，每次5min，山羊血清室溫封閉2h，棄血清，按1∶200比例加一抗GFAP，按1∶500比例加一抗Tuj1，4℃濕盒過夜，PBS洗滌，羊抗兔抗體(1∶200)室溫下避光孵育2h，PBS洗滌，加DAPI染料(1∶50稀釋)染色10min，PBS洗滌，抗熒光猝滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察，使用Image J軟件分析光密度值。

1.3.6 下丘腦神經(jīng)前體細胞中GFAP啟動子區(qū)域的甲基化測定 用動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒提取DNA，將獲取的DNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。采用核酸定量儀檢測DNA含量和純度。用甲基化特異性PCR試劑盒對DNA樣本進行重亞硫酸鹽轉化，PCR反應條件：95℃ 5min，1個循環(huán)；94℃ 20s,60℃ 30s，72℃ 20s，35個循環(huán)后72℃ 5min。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。GFAP啟動子甲基化上游引物：5'-ATATAGTGAATTTTAGGGGATACGA-3',下游引物：5'-CTCTACTCCATACCAAAAACACGAT-3'；未甲基化上游引物：5'-ATATAGTGAATTTTAGGGGATATGA-3'，下游引物：5'-CTCTACTCCATACCAAAAACACAAT-3'。MSP結果判讀：完全甲基化：甲基化特異引物擴增出目的條帶，而非甲基化特異引物沒有擴增出目的條帶；部分甲基化：甲基化特異引物和非甲基化特異引物均擴增出目的條帶；非甲基化：非甲基化特異引物擴增出目的條帶，而甲基化特異引物沒有擴增出目的條帶。本研究將完全甲基化與部分甲基化均按甲基化統(tǒng)計。

2 結 果

2.1 出生體重的比較 所有后代鼠的體重均為自然分娩后第一天立即測量所得。SGA組的所有后代鼠(不區(qū)分性別)體重均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明建模成功，見表1。

表1 SGA組和對照組不同孕周后代鼠體重對比

2.2 小于胎齡子代鼠下丘腦NPCs分化改變及SIRT1、TET2、GFAP的表達變化

2.2.1 SGA大鼠下丘腦中NPCs分化為星形膠質細胞的比例增加 GFAP為星形膠質細胞的活化標記物，Tuj1為神經(jīng)元活化標記物。免疫熒光結果顯示，SGA組子鼠下丘腦組織中GFAP表達增加，Tuj1表達減少，神經(jīng)元與星形膠質細胞的比例(Tuj1/GFAP)與對照組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。兩組子鼠下丘腦熒光染色見圖1，Tuj1/GFAP熒光光密度值比值對比見圖2。

圖1 對照組和SGA組子鼠下丘腦GFAP、Tuj1免疫熒光染色(100×)紅色熒光為GFAP表達，綠色熒光為Tuj1表達，藍色熒光為DAPI核染

2.2.2 SGA子鼠下丘腦中SIRT1、TET2、GFAP蛋白和mRNA表達增加 Western blot結果表明，與對照組相比，SGA組子鼠下丘腦組織中SIRT1(P<0.01)、TET2(P<0.05)、GFAP(P<0.05)蛋白表達均顯著增加，見圖3。RT-PCR定量分析結果顯示,與對照組相比，SGA組子鼠下丘腦組織中SIRT1(P<0.01)、TET2(P<0.01)、GFAP(P<0.05)mRNA表達增多，見圖4。

2.2.3 SGA組子鼠下丘腦GFAP啟動子區(qū)域甲基化水平降低 SGA組子鼠GFAP啟動子區(qū)域甲基化水平降低，非甲基化水平增高。電泳條帶灰度值分析結果見圖5A。甲基化/非甲基化灰度值比值分析見圖5B，結果表明，SGA組子鼠GFAP啟動子區(qū)域甲基化/非甲基化水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 對照組和SGA組子鼠下丘腦Tuj1/GFAP雙重免疫熒光染色平均熒光光密度比值分析

圖3 對照組及SGA組子鼠下丘腦SIRT1(A)、TET2(B)、GFAP(C)蛋白表達

圖4 對照組及SGA組子鼠下丘腦SIRT1(A)、TET2(B)、GFAP(C)mRNA的表達

2.3 SIRT1介導的TET2活性變化促進星形膠質細胞分化

2.3.1 SIRT1調控下丘腦神經(jīng)細胞中的TET2表達進而調節(jié)GFAP表達水平 神經(jīng)前體細胞體外分化培養(yǎng)，收集細胞，Western blot法分析SIRT1、TET2、GFAP蛋白表達。SGA組子鼠的SIRT1表達高于對照組(P<0.01)(圖6A、B)，分別在SGA組和對照組培養(yǎng)基中加SIRT1抑制劑sirtinol(50μmol/L)，培養(yǎng)8天后，收集細胞。相對于未添加抑制劑或激活劑組，SIRT1表達受明顯抑制(P<0.05)；同樣，加SIRT1激活劑白藜蘆醇(50μmol/L)培養(yǎng)8天后，SIRT1表達增加(P<0.05)。表明加入的相關酶試劑對SIRT1的抑制及激活有效。相比于對照組，SGA組子鼠的TET2、GFAP蛋白表達增加(圖6C、D)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在加sirtinol培養(yǎng)后，對照組和SGA組的TET2、GFAP表達均減少，低于各自未做處理的空白組，差異有統(tǒng)計學意義；在加白藜蘆醇培養(yǎng)后，對照組和SGA組的TET2、GFAP表達均增加，高于各自未作處理的空白組，差異均有統(tǒng)計學意義(圖6C、D)。RT-PCR法分析對照組、SGA組SIRT1、TET2、GFAP在不同處理條件下的mRNA表達，結果同Western blot(圖7)。

圖5 對照組及SGA組子鼠下丘腦GFAP啟動子區(qū)域甲基化水平分析

圖6 對照組及SGA組子鼠下丘腦SIRT1、TET2、GFAP蛋白的表達

2.3.2 SIRT1介導的TET2活性改變、調節(jié)GFAP啟動子區(qū)域的甲基化水平 MSP法測定體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞中GFAP啟動子區(qū)域的甲基化水平，見圖8。與對照組相比，SGA組子鼠的GFAP啟動子區(qū)域甲基化水平降低，非甲基化水平升高，加sirtinol干預后，SGA組和對照組的甲基化水平均升高，非甲基化水平均降低。用白藜蘆醇干預后，SGA組和對照組的甲基化水平均降低，非甲基化水平均增加。電泳條帶灰度值分析結果顯示，SGA組的甲基化水平低于對照組，加sirtinol的SGA組和對照組甲基化水平相對于各自的空白處理組均有所升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),加白藜蘆醇處理后SGA組和對照組甲基化水平均降低，低于各自的空白處理組，差異有統(tǒng)計學意義。

圖7 control組及SGA組子鼠下丘腦SIRT1(A)、TET2(B)、GFAP(C)mRNA的表達

圖8 control組及SGA組子鼠GFAP啟動子區(qū)域甲基化水平分析

3 討 論

SGA一直以來都受到廣泛關注。SGA不僅會導致圍產(chǎn)期的死亡率和患病率增加，還會引起兒童生長時期甚至成年后發(fā)育和代謝異常。目前國內外建立SGA動物模型主要有外科手術法、被動吸煙法、母體營養(yǎng)不良法、饑餓(限制飲食)法[17],其中限制飲食法的應用較為廣泛且成熟。本研究運用限制飲食法，具體采用8%低蛋白飲食喂養(yǎng)、孕10天起50%限制飲食進行建模，以SGA組子鼠出生體重低于對照組出生體重2個標準差為建模成功標準，結果顯示對照組后代鼠體重明顯大于SGA組后代鼠，SGA模型建立成功。SGA由于神經(jīng)發(fā)育遲緩，在嬰兒期、學齡期的認知能力和學習能力低下，青春期出現(xiàn)體重追趕性增長以及成年后肥胖的風險增加[18]。在哺乳動物大腦中，NPCs分化為神經(jīng)元和膠質細胞對維持大腦功能、保證其正常發(fā)育具有重要意義，NPCs是一種終生具有自我更新能力的細胞，誘導后可分化為特定類型的神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞[19]。在大腦皮層的正常發(fā)育過程中，NPCs首先分化為神經(jīng)元，隨后逐漸分化為星形膠質細胞和少突膠質細胞[20]。研究發(fā)現(xiàn)，SGA下丘腦NPCs增殖分化受損，提前且傾向于分化為星形膠質細胞，導致下丘腦中調控食欲的神經(jīng)元發(fā)育異常[21]。本實驗研究中，利用雙重免疫熒光染色對星形膠質細胞的活化標記物(GFAP)以及神經(jīng)元的標記物(Tuj1)在新生大鼠下丘腦中的表達進行了分析，結果表明SGA新生大鼠下丘腦中的GFAP表達高于正常組，而Tuj1表達降低，提示SGA子鼠下丘腦NPCs存在分化異常，分化為星形膠質細胞的比例增多。

近年來，國內外越來越多的研究表明，異常的DNA甲基化會影響胎兒的宮內發(fā)育，與小于胎齡兒的發(fā)生有關[22-24]。DNA甲基化在神經(jīng)發(fā)生的過程中起多種作用，NPCs早期分化為神經(jīng)元時，神經(jīng)膠質譜系基因被DNA甲基化作用所抑制[25]，因此，DNA甲基化的異常變化能影響NPCs的分化命運，對神經(jīng)元及星形膠質細胞的存活至關重要。目前普遍認為，DNA甲基化水平與基因表達成反比，高甲基化水平會抑制基因的表達[26]。GFAP啟動子區(qū)域的甲基化水平是胚胎神經(jīng)發(fā)生過程中星形膠質細胞分化的關鍵決定因素，GFAP的活性表達以及星形膠質細胞的生成與GFAP啟動子區(qū)域的甲基化水平呈負相關[11-12]。我們利用甲基化特異性PCR(MSP)方法測定SGA和正常新生大鼠下丘腦組織中GFAP啟動子區(qū)域的的甲基化水平。結果顯示SGA子鼠的GFAP甲基化水平明顯低于正常對照組，與GFAP的蛋白及mRNA表達增加這一結果相符，證明了SGA下丘腦中GFAP的活性增加可能與其啟動子區(qū)甲基化水平降低相關。DNA去甲基化依賴于去甲基化酶，TET2(ten-eleven translocation)蛋白是一種α-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶，是DNA去甲基化過程中的一種重要的酶，將5-甲基胞嘧啶(5mc)氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmc)，而5hmc的沉積觸發(fā)被動的DNA去甲基化[27]。He等[14]發(fā)現(xiàn)，TET2的過表達促進NPCs向星形膠質細胞分化，使用shRNA敲低TET2的表達后，明顯降低了NPCs向星形膠質細胞分化的比例，這一結果也說明了TET2是星形膠質細胞譜系分化的關鍵調節(jié)劑。本研究結果顯示，SGA大鼠下丘腦組織中TET2、GFAP表達均高于對照組，且GFAP的DNA甲基化水平降低，提示在SGA子鼠的下丘腦中，GFAP啟動子區(qū)域甲基化水平的降低可能是被TET2活性的變化所調控。

TET2的活性受乙?；饔玫恼{節(jié)[28]。SIRT1屬于依賴NAD+的Ⅲ類組蛋白脫乙酰酶，與組蛋白乙?；腹餐S持細胞核的乙?；胶?。最近一項關于骨髓增生異常綜合征中造血干細胞的研究表明，SIRT1與TET2催化域中的保守賴氨酸殘基融合，從而增強了TET2的活性，抑制造血干細胞的異常增殖[29]。Simeoni等[30]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1對TET2催化域內的K1472、K1473和K1478等保守賴氨酸殘基位點進行脫乙?；稍鰪奣ET2與DNA的相互作用，提高TET2的催化活性。此外，SIRT1參與體內許多生理功能的調節(jié)，在胚胎發(fā)育時期，SIRT1在腦部高度表達，影響神經(jīng)元和腦發(fā)育[31]。Desai等[9]對SGA動物模型進行體外神經(jīng)球培養(yǎng)實驗，研究表明，SGA新生兒和成年后代的下丘腦中NPCs增殖減少，神經(jīng)元標記物Tuj1降低，SIRT1表達增加。沉默SIRT1后，NPCs增殖恢復正常水平，Tuj1表達增加。證明了SGA下丘腦中SIRT1高表達誘導了NPCs的過早分化，減少其增殖，使NPCs向星形膠質細胞分化增加，分化為神經(jīng)元的數(shù)目變少。

為進一步驗證SGA下丘腦中SIRT1與TET2之間是否存在調控關系以及對NPCs向星形膠質細胞分化的影響，本實驗通過體外神經(jīng)細胞培養(yǎng)的方式，通過在培養(yǎng)基中加入SIRT1抑制劑(sirtinol)或SIRT1激活劑(白藜蘆醇)對SIRT1的活性進行干預處理，各組SIRT1表達均被有效干預。與不做處理的空白組相比，加入sirtinol組的TET2及GFAP活性降低，加入白藜蘆醇組的TET2、GFAP活性增加。表明在SGA下丘腦NPCs分化時，SIRT1的高表達增加了TET2的活性，使GFAP表達增加，星形膠質細胞分化增加。為明確這一調控過程是否是通過影響GFAP啟動子區(qū)域甲基化水平而實現(xiàn)，采用MSP方法測定不同干預條件下各組的GFAP啟動子區(qū)域甲基化水平，結果表明，加入sirtinol的SGA組GFAP啟動子區(qū)域甲基化水平增加，非甲基化水平降低，加入白藜蘆醇后，SGA組GFAP啟動子區(qū)域的甲基化水平降低，非甲基化水平增加。提示SGA下丘腦中SIRT1可能通過介導TET2的活性改變，調節(jié)GFAP啟動子區(qū)域的甲基化水平，從而影響星形膠質細胞的分化。

綜上所述，在SGA下丘腦中，SIRT1的高表達可能增強了TET2的活性，繼而改變TET2的功能，使GFAP啟動子區(qū)域的DNA去甲基化水平增加，從而增加GFAP表達，促進星形膠質細胞的分化。