劉志濤，劉剛，陳霞，王歲月

糖尿病性視網(wǎng)膜病是成年人失明的主要原因[1-2]，據(jù)報道，60%以上的2型糖尿病病人在發(fā)病數(shù)年后出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變[3]。目前，盡管相關學者已經(jīng)就導致糖尿病引起的視網(wǎng)膜損傷的潛在原因進行了大量工作，但糖尿病性視網(wǎng)膜病的機制仍未完全了解。眾所周知，高血糖是導致糖尿病性視網(wǎng)膜病發(fā)作和發(fā)展的關鍵危險因素。慢性高血糖癥會損害多種細胞類型，并導致包括眼睛在內的許多器官功能障礙和衰竭[4]。對高葡萄糖相關的病理學途徑的了解越來越重要，了解高葡萄糖反應相關細胞途徑對于糖尿病性視網(wǎng)膜病治療至關重要。

微小RNA（microRNA，21至23個核苷酸的小的非編碼RNA小分子）作為基因表達的新興關鍵調控因子在調節(jié)多種細胞活動（包括細胞發(fā)育、增殖、分化和凋亡）方面具有重要作用[5-6]。目前，部分miRNA已經(jīng)作為診斷某些疾病的潛在生物標志物進行臨床應用[7-9]。miRNA表達及其功能具有組織和細胞特異性。糖尿病與胰島素靶組織以及胰島素分泌細胞中幾種miRNA的表達改變有關。其他研究發(fā)現(xiàn) miR-19a、miR-1740、miR-126、miR-200等 miRNA在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中發(fā)生異常表達[10-14]。然而，迄今為止，只有很少的研究考察了miRNA的下游細胞信號傳導，且關于miRNA如何影響糖尿病性視網(wǎng)膜病常見的病理機制尚未完全揭示。最近，有研究發(fā)現(xiàn)在人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）中miR-16的過表達在抑制血管生成中發(fā)揮重要作用[15]。另一項研究發(fā)現(xiàn)miR-16在鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內皮細胞（REC）中表達增加[11]。然而，關于miR-16在人視網(wǎng)膜內皮細胞中的表達及其在與糖尿病性視網(wǎng)膜病發(fā)病機制相關的下游細胞信號傳導中的潛在作用知之甚少。

其他研究報道，在高葡萄糖條件下，視網(wǎng)膜內皮細胞中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平升高。TNF-α可激活細胞因子信號轉導負調控因子（SOCS3）信號，以及胰島素受體底物1（IRS-1）和胰島素受體（IR）的磷酸化，導致在高葡萄糖條件下正常胰島素信號傳導的抑制[16]。本研究自2019年2―8月考察miR-16在高糖誘導人視網(wǎng)膜血管內皮細胞凋亡中的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)人視網(wǎng)膜內皮細胞購自美國ATCC。細胞在含有微血管生長補充劑、10 μg/mL慶大霉素和0.25 μg/mL兩性霉素B的M131培養(yǎng)基中培養(yǎng)（美國Invitrogen公司）。將細胞在正常葡萄糖培養(yǎng)基（5 mmol/L）或高葡萄糖培養(yǎng)基（30 mmol/L）（美國Invitrogen公司）中培養(yǎng)3 d。通過在無生長補充劑的高葡萄糖或正常葡萄糖培養(yǎng)基中孵育20 h使細胞靜止并用于后續(xù)實驗。

1.2 microRNA模擬物轉染細胞按照制造商的說明，使用Oligofectamine（美國Invitrogen公司）將miRNA模擬物[miR-16-mimic，生工生物工程（上海）股份有限公司合成]轉染視網(wǎng)膜內皮細胞，終濃度為50 nmol/L。用等濃度的模擬物陰性對照（miRNC）處理陰性對照組。通過實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）驗證miRNA表達水平。

1.3 qRT-PCR使用TRIzol方法（美國Invitrogen公司）分離和純化總RNA。對于polyA尾法逆轉錄酶PCR，將5 μg總RNA在室溫下用DNase I[中科瑞泰（北京）生物科技有限公司]處理15 min，然后使用polyA聚合酶[生工生物工程（上海）股份有限公司]在37℃下處理1 h。最終的反應混合物用苯酚/氯仿萃取，異丙醇沉淀，然后重新溶于25 μL焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的水中。使用Superscript Ⅱ逆轉錄酶（美國Invitrogen公司）和oligo-dT錨定引物5'GCGACGCAATAACTCTGGTTTGACTTAATTTAGTATTTAACTTTVN3'將 PolyA 尾 RNA（6 μL）逆轉錄成第一鏈cDNA。對于PCR，使用SYBR Green I在LightCycler 480實時PCR系統(tǒng)（美國Roche Applied Science公司）上進行PCR。反應中使用的引物序列如下 ：miR-16，正向 ：CAAAAAGCGGCTACTTTAAGCACTC，反向 ：TCGAAGTTACACCGGTTCCAGAAGGA；U6，正向：GCTTCAGCTCATGGGATTCCAAC，反向：TGCATCCCTCATGTAGCTTGGG。U6用作內源對照。采用比較閾值循環(huán)（2?ΔΔCt）方法計算mRNA相對表達量。

1.4 蛋白質印跡法（Western blotting）分析用冷PBS沖洗細胞后，將視網(wǎng)膜內皮細胞收集在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液中（上海碧云天生物技術有限公司）。在預制的tris-甘氨酸凝膠（美國Invitrogen公司）上分離等量的蛋白質，然后將其印跡到硝酸纖維素膜上。在TBST（10 mmol/L Tris-HCl緩沖液、pH 8.0、150 mmol/L NaCl、0.1%Tween 20）和5%（W/V）BSA中封閉1 h后，將膜用相應的一抗在4℃過夜孵育，然后用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h。通過增強的化學發(fā)光試劑盒（Cell Signaling Technology公司）檢測免疫條帶。GAPDH作為內部對照。使用的一抗包括TNF-α、胰島素受體底物-1絲氨酸307（IRS-1 Ser307）、磷酸化的 IRS-1 Ser307、SOCS3、胰島素受體 Tyr1150（IR Tyr1150）、磷酸化的IR Tyr1150、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化的Akt、活化的胱天蛋白酶-3（cleaved caspase 3）和1-甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）。所有抗體全部購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.5 統(tǒng)計學方法使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以±s表示。使用Studentt檢驗進行兩組間數(shù)據(jù)比較，實驗采用單因素方差分析和LSD法進行多組間數(shù)據(jù)比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 高糖抑制視網(wǎng)膜內皮細胞中miR-16的表達水平本研究檢測了高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的視網(wǎng)膜內皮細胞中miR-16表達的變化。通過在高葡萄糖培養(yǎng)基（25 mmol/L）中培養(yǎng)視網(wǎng)膜內皮細胞，并從細胞中分離出總RNA，然后進行qRT-PCR。qRT-PCR結果顯示，與正常葡萄糖組相比，高葡萄糖培養(yǎng)可顯著降低miR-16的水平[對照組（1.07±0.08）比高糖組（0.35±0.03），t=14.43，P=0.011]。由于高葡萄糖導致miR-16的表達降低，本研究通過對視網(wǎng)膜內皮細胞轉染miR-16模擬物（50 nmol/L）48 h來增加miR-16的表達。qRT-PCR證實了轉染后細胞內miR-16的表達顯著增加[高糖+miR-NC組（1.01±0.07）比高糖+miR-16組（3.54±0.27），t=18.55，P=0.004]。

2.2 上調miR-16降低視網(wǎng)膜內皮細胞中的TNF-α水平及IRS-1 Ser307的磷酸化為了確定miRNA-16是否參與胰島素信號傳導，本研究考察了改變miRNA-16的表達對糖尿病性視網(wǎng)膜病變相關下游信號通路的影響。其他研究者已經(jīng)證明TNF-α水平在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中明顯升高[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，用miR-16轉染的視網(wǎng)膜內皮細胞的TNF-α水平顯著降低（圖1A和表1）。因此，miR-16的過表達可降低高葡萄糖誘導的視網(wǎng)膜內皮細胞中的TNF-α水平。另外，敲低TNF-α會導致IRS-1 Ser307的磷酸化降低，從而促進正常的胰島素信號轉導[16]。在本研究中，高葡萄糖條件下培養(yǎng)的細胞中的IRS-1磷酸化水平明顯增加，而上調miRNA-16可抑制IRS-1 Ser307的磷酸化（圖1B和表1）。這表明miR-16可能在視網(wǎng)膜內皮細胞中通過抑制TNF-α來抑制IRS-1Ser307的磷酸化。

圖1 上調miR-16降低視網(wǎng)膜內皮細胞中的蛋白磷酸化：A為TNF-α；B為胰島素受體底物-1（IRS-1）Ser307

表1 各組腫瘤壞死因子-α（TNF-α）蛋白相對表達量和胰島素受體底物-1（IRS-1）磷酸化情況/±s

表1 各組腫瘤壞死因子-α（TNF-α）蛋白相對表達量和胰島素受體底物-1（IRS-1）磷酸化情況/±s

組別 重復次對照高糖高糖+miR-NC高糖+miR-16-mimic F值P值數(shù) 3 3 3 3 TNF-α蛋白相對表達量0.24±0.02 1.21±0.09 1.17±0.09 0.55±0.04 33.66 0.001 p-IRS-1 Ser307/total-IRS-1 0.16±0.01 0.86±0.06 0.77±0.05 0.44±0.03 21.46 0.001

2.3 上調miR-16降低視網(wǎng)膜內皮細胞中的SOCS3水平前人研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可激活視網(wǎng)膜內皮細胞中的SOCS3信號[16]。本研究考察了miR-16是否會改變高葡萄糖誘導的視網(wǎng)膜內皮細胞中的SOCS3水平。Western blotting數(shù)據(jù)表明，高葡萄糖處理顯著增加了視網(wǎng)膜內皮細胞中的SOCS3水平，而miR-16的過表達則顯著降低了SOCS3的水平（圖2和表2）。因此miR-16在高葡萄糖誘導的視網(wǎng)膜內皮細胞中抑制SOCS3信號傳導。

圖2 上調miR-16降低視網(wǎng)膜內皮細胞中的細胞因子信號轉導負調控因子（SOCS3）水平

表2 各組細胞因子信號轉導負調控因子（SOCS3）蛋白相對表達量/±s

表2 各組細胞因子信號轉導負調控因子（SOCS3）蛋白相對表達量/±s

組別對照高糖高糖+miR-NC高糖+miR-16-mimic F值P值重復次數(shù)3 3 3 3 SOCS3蛋白相對表達量0.33±0.02 1.67±0.12 1.75±0.13 0.67±0.05 22.14 0.001

2.4 上調miR-16增強視網(wǎng)膜內皮細胞中IR Tyr1150的磷酸化高血糖癥中SOCS3和TNF-α的增加可通過促進IRS-1 Ser307磷酸化并抑制IR Tyr1150的磷酸化來抑制正常胰島素信號[17]。在本研究中，高葡萄糖條件下培養(yǎng)的視網(wǎng)膜內皮細胞中IRTyr1150磷酸化水平明顯降低，上調miR-16則會提高IRTyr1150磷酸化水平（圖3和表3）。結果表明，胰島素受體是視網(wǎng)膜內皮細胞中受miR-16調節(jié)的靶途徑之一，而高水平的miR-16可在高血糖癥中保護視網(wǎng)膜內皮細胞。

圖3 上調miR-16增強視網(wǎng)膜內皮細胞中胰島素受體Tyr1150（IR Tyr1150）的磷酸化

表3 各組胰島素受體Tyr1150（IR Tyr1150）磷酸化/±s

表3 各組胰島素受體Tyr1150（IR Tyr1150）磷酸化/±s

組別對照高糖高糖+miR-NC高糖+miR-16-mimic F值P值重復次數(shù)3 3 3 3 p-IR Tyr1150/total-IR Tyr1150 1.01±0.07 0.32±0.02 0.35±0.02 0.92±0.07 16.78 0.003

2.5 上調miR-16在視網(wǎng)膜內皮細胞中增加Akt磷酸化并減少細胞凋亡本研究考察了miR-16的上調對視網(wǎng)膜內皮細胞中Akt的磷酸化的影響。研究發(fā)現(xiàn)，高葡萄糖培養(yǎng)降低了Akt磷酸化，而miR-16模擬物處理則可促進Akt的磷酸化（圖4A和表4）。

圖4 上調miR-16在視網(wǎng)膜內皮細胞中增加Akt磷酸化（A）并減少cleaved caspase 3（B）的水平

表4 各組的蛋白激酶B（Akt）磷酸化和活化的胱天蛋白酶-3（cleaved caspase 3）蛋白相對表達量/±s

表4 各組的蛋白激酶B（Akt）磷酸化和活化的胱天蛋白酶-3（cleaved caspase 3）蛋白相對表達量/±s

組別 重復次數(shù)p-Akt/total-Akt cleaved caspase 3蛋白相對表達量0.73±0.05 0.31±0.02 0.28±0.02 0.86±0.06 33.66 0.001對照高糖高糖+miR-NC高糖+miR-16-mimic F值P值3 3 3 3 0.73±0.05 1.58±0.12 1.44±0.11 0.82±0.06 21.46 0.001

此外，miR-16的過表達顯著降低了高葡萄糖中cleaved caspase 3的水平（圖4B和表4）。這些結果表明，miR-16可以通過激活Akt信號途徑來抑制高葡萄糖誘導的視網(wǎng)膜內皮細胞凋亡。

3 討論

微血管修飾是糖尿病性視網(wǎng)膜病變的重要改變之一。其他工作者已經(jīng)證明，視網(wǎng)膜內皮細胞是在糖尿病性視網(wǎng)膜病中受到實質影響的關鍵細胞類型之一[13，18]，但尚不清楚糖尿病性視網(wǎng)膜病的潛在細胞機制。糖尿病視網(wǎng)膜病變的新潛在因素是miRNA的調節(jié)。其他研究表明miR-200b在高葡萄糖條件處理的HUVEC中被下調[19]。此外，高糖可通過降低HUVEC中miR-146a的表達來調節(jié)糖尿病中細胞外基質蛋白的產(chǎn)生[20]。本研究旨在探討miR-16對高葡萄糖引起的人類視網(wǎng)膜內皮細胞損傷的影響。據(jù)報道，miR-16在多種哺乳動物組織中表達，包括腦、心臟、骨骼肌、肝、肺、腎、脾臟等[21-23]。本研究證明了miR-16可在人視網(wǎng)膜內皮細胞中表達，并且高糖處理可抑制人類視網(wǎng)膜內皮細胞中miRNA的水平。

其他研究者發(fā)現(xiàn)，高葡萄糖會增加視網(wǎng)膜內皮細胞中的TNF-α和SOCS3蛋白水平，TNF-α和SOCS3水平的升高會導致IRS-1 Ser307磷酸化增強，以及IR Tyr115磷酸化降低，從而導致胰島素抵抗和凋亡增加[16-17]。敲低 TNF-α會導致 IRS-1 Ser307的磷酸化降低，從而促進正常的胰島素信號轉導。此外，上調TNF-α可激活視網(wǎng)膜內皮細胞中的SOCS3信號[16]。miR及其靶標之間的調控網(wǎng)絡很復雜，因為單個miRNA可以與數(shù)百個靶基因結合，而一個靶基因可以被多個miRNA調控[24]。各種miRNA靶向不同水平的胰島素信號傳導的分子。不同的miRNA參與信號蛋白的表達，例如胰島素、IRS-1 和 IRS-2和 Akt[25]。本研究證實視網(wǎng)膜內皮細胞中miR-16的水平升高可抑制TNF-α和SOCS3的信號轉導。此外，上調miRNA-16可抑制IRS-1 Ser307的磷酸化并促進IR Tyr 1150的磷酸化。這表明miR-16可能在視網(wǎng)膜內皮細胞中通過抑制TNF-α和SOCS3信號通路來調節(jié)下游信號分子如IRS-1 Ser307和IR Tyr 1150的表達，從而發(fā)揮視網(wǎng)膜內皮細胞保護作用。

據(jù)報道，TNF-α水平降低可導致Akt磷酸化增加，從而抑制細胞凋亡[26]。TNF-α水平升高導致cleaved caspase 3水平升高并引起細胞凋亡[27]。在高葡萄糖情況下，視網(wǎng)膜內皮細胞中Akt磷酸化水平的降低會顯著增加促凋亡蛋白如cleaved caspase 3的表達[16]。因此，本研究考察了miR-16的上調是否可以增加視網(wǎng)膜內皮細胞中Akt的磷酸化。研究發(fā)現(xiàn)，高葡萄糖培養(yǎng)降低了Akt磷酸化，而miR-16模擬物處理則可促進Akt的磷酸化。此外，miR-16的過表達顯著降低了高葡萄糖中cleaved caspase 3的水平。這些結果表明，miR-16可以通過激活Akt信號途徑來抑制高葡萄糖誘導的視網(wǎng)膜內皮細胞凋亡。

綜上所述，本研究表明，miR-16通過抑制TNF-α和SOCS3信號通路來抑制IRS-1 Ser307的磷酸化并促進IRTyr1150和Akt的磷酸化，從而在抑制胰島素抵抗中發(fā)揮作用，并包括視網(wǎng)膜內皮細胞保護免受高葡萄糖誘導的細胞凋亡。這一結果表明，miR-16是糖尿病性視網(wǎng)膜病的潛在治療靶標。