劉志濤,劉剛,陳霞,王歲月
糖尿病性視網(wǎng)膜病是成年人失明的主要原因[1-2],據(jù)報道,60%以上的2型糖尿病病人在發(fā)病數(shù)年后出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變[3]。目前,盡管相關(guān)學(xué)者已經(jīng)就導(dǎo)致糖尿病引起的視網(wǎng)膜損傷的潛在原因進(jìn)行了大量工作,但糖尿病性視網(wǎng)膜病的機(jī)制仍未完全了解。眾所周知,高血糖是導(dǎo)致糖尿病性視網(wǎng)膜病發(fā)作和發(fā)展的關(guān)鍵危險因素。慢性高血糖癥會損害多種細(xì)胞類型,并導(dǎo)致包括眼睛在內(nèi)的許多器官功能障礙和衰竭[4]。對高葡萄糖相關(guān)的病理學(xué)途徑的了解越來越重要,了解高葡萄糖反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞途徑對于糖尿病性視網(wǎng)膜病治療至關(guān)重要。
微小RNA(microRNA,21至23個核苷酸的小的非編碼RNA小分子)作為基因表達(dá)的新興關(guān)鍵調(diào)控因子在調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(包括細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化和凋亡)方面具有重要作用[5-6]。目前,部分miRNA已經(jīng)作為診斷某些疾病的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行臨床應(yīng)用[7-9]。miRNA表達(dá)及其功能具有組織和細(xì)胞特異性。糖尿病與胰島素靶組織以及胰島素分泌細(xì)胞中幾種miRNA的表達(dá)改變有關(guān)。其他研究發(fā)現(xiàn) miR-19a、miR-1740、miR-126、miR-200等 miRNA在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中發(fā)生異常表達(dá)[10-14]。然而,迄今為止,只有很少的研究考察了miRNA的下游細(xì)胞信號傳導(dǎo),且關(guān)于miRNA如何影響糖尿病性視網(wǎng)膜病常見的病理機(jī)制尚未完全揭示。最近,有研究發(fā)現(xiàn)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中miR-16的過表達(dá)在抑制血管生成中發(fā)揮重要作用[15]。另一項研究發(fā)現(xiàn)miR-16在鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(REC)中表達(dá)增加[11]。然而,關(guān)于miR-16在人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)及其在與糖尿病性視網(wǎng)膜病發(fā)病機(jī)制相關(guān)的下游細(xì)胞信號傳導(dǎo)中的潛在作用知之甚少。
其他研究報道,在高葡萄糖條件下,視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平升高。TNF-α可激活細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子(SOCS3)信號,以及胰島素受體底物1(IRS-1)和胰島素受體(IR)的磷酸化,導(dǎo)致在高葡萄糖條件下正常胰島素信號傳導(dǎo)的抑制[16]。本研究自2019年2―8月考察miR-16在高糖誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的分子機(jī)制。
1.1 細(xì)胞培養(yǎng)人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞購自美國ATCC。細(xì)胞在含有微血管生長補(bǔ)充劑、10 μg/mL慶大霉素和0.25 μg/mL兩性霉素B的M131培養(yǎng)基中培養(yǎng)(美國Invitrogen公司)。將細(xì)胞在正常葡萄糖培養(yǎng)基(5 mmol/L)或高葡萄糖培養(yǎng)基(30 mmol/L)(美國Invitrogen公司)中培養(yǎng)3 d。通過在無生長補(bǔ)充劑的高葡萄糖或正常葡萄糖培養(yǎng)基中孵育20 h使細(xì)胞靜止并用于后續(xù)實驗。
1.2 microRNA模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞按照制造商的說明,使用Oligofectamine(美國Invitrogen公司)將miRNA模擬物[miR-16-mimic,生工生物工程(上海)股份有限公司合成]轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞,終濃度為50 nmol/L。用等濃度的模擬物陰性對照(miRNC)處理陰性對照組。通過實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)驗證miRNA表達(dá)水平。
1.3 qRT-PCR使用TRIzol方法(美國Invitrogen公司)分離和純化總RNA。對于polyA尾法逆轉(zhuǎn)錄酶PCR,將5 μg總RNA在室溫下用DNase I[中科瑞泰(北京)生物科技有限公司]處理15 min,然后使用polyA聚合酶[生工生物工程(上海)股份有限公司]在37℃下處理1 h。最終的反應(yīng)混合物用苯酚/氯仿萃取,異丙醇沉淀,然后重新溶于25 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水中。使用Superscript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Invitrogen公司)和oligo-dT錨定引物5'GCGACGCAATAACTCTGGTTTGACTTAATTTAGTATTTAACTTTVN3'將 PolyA 尾 RNA(6 μL)逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。對于PCR,使用SYBR Green I在LightCycler 480實時PCR系統(tǒng)(美國Roche Applied Science公司)上進(jìn)行PCR。反應(yīng)中使用的引物序列如下 :miR-16,正向 :CAAAAAGCGGCTACTTTAAGCACTC,反向 :TCGAAGTTACACCGGTTCCAGAAGGA;U6,正向:GCTTCAGCTCATGGGATTCCAAC,反向:TGCATCCCTCATGTAGCTTGGG。U6用作內(nèi)源對照。采用比較閾值循環(huán)(2?ΔΔCt)方法計算mRNA相對表達(dá)量。
1.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)分析用冷PBS沖洗細(xì)胞后,將視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞收集在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液中(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。在預(yù)制的tris-甘氨酸凝膠(美國Invitrogen公司)上分離等量的蛋白質(zhì),然后將其印跡到硝酸纖維素膜上。在TBST(10 mmol/L Tris-HCl緩沖液、pH 8.0、150 mmol/L NaCl、0.1%Tween 20)和5%(W/V)BSA中封閉1 h后,將膜用相應(yīng)的一抗在4℃過夜孵育,然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒(Cell Signaling Technology公司)檢測免疫條帶。GAPDH作為內(nèi)部對照。使用的一抗包括TNF-α、胰島素受體底物-1絲氨酸307(IRS-1 Ser307)、磷酸化的 IRS-1 Ser307、SOCS3、胰島素受體 Tyr1150(IR Tyr1150)、磷酸化的IR Tyr1150、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化的Akt、活化的胱天蛋白酶-3(cleaved caspase 3)和1-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。所有抗體全部購自美國Cell Signaling Technology公司。
1.5 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以±s表示。使用Studentt檢驗進(jìn)行兩組間數(shù)據(jù)比較,實驗采用單因素方差分析和LSD法進(jìn)行多組間數(shù)據(jù)比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 高糖抑制視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中miR-16的表達(dá)水平本研究檢測了高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中miR-16表達(dá)的變化。通過在高葡萄糖培養(yǎng)基(25 mmol/L)中培養(yǎng)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞,并從細(xì)胞中分離出總RNA,然后進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR結(jié)果顯示,與正常葡萄糖組相比,高葡萄糖培養(yǎng)可顯著降低miR-16的水平[對照組(1.07±0.08)比高糖組(0.35±0.03),t=14.43,P=0.011]。由于高葡萄糖導(dǎo)致miR-16的表達(dá)降低,本研究通過對視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-16模擬物(50 nmol/L)48 h來增加miR-16的表達(dá)。qRT-PCR證實了轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miR-16的表達(dá)顯著增加[高糖+miR-NC組(1.01±0.07)比高糖+miR-16組(3.54±0.27),t=18.55,P=0.004]。
2.2 上調(diào)miR-16降低視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的TNF-α水平及IRS-1 Ser307的磷酸化為了確定miRNA-16是否參與胰島素信號傳導(dǎo),本研究考察了改變miRNA-16的表達(dá)對糖尿病性視網(wǎng)膜病變相關(guān)下游信號通路的影響。其他研究者已經(jīng)證明TNF-α水平在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中明顯升高[16]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照相比,用miR-16轉(zhuǎn)染的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的TNF-α水平顯著降低(圖1A和表1)。因此,miR-16的過表達(dá)可降低高葡萄糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的TNF-α水平。另外,敲低TNF-α?xí)?dǎo)致IRS-1 Ser307的磷酸化降低,從而促進(jìn)正常的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。在本研究中,高葡萄糖條件下培養(yǎng)的細(xì)胞中的IRS-1磷酸化水平明顯增加,而上調(diào)miRNA-16可抑制IRS-1 Ser307的磷酸化(圖1B和表1)。這表明miR-16可能在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中通過抑制TNF-α來抑制IRS-1Ser307的磷酸化。
圖1 上調(diào)miR-16降低視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的蛋白磷酸化:A為TNF-α;B為胰島素受體底物-1(IRS-1)Ser307
表1 各組腫瘤壞死因子-α(TNF-α)蛋白相對表達(dá)量和胰島素受體底物-1(IRS-1)磷酸化情況/±s
表1 各組腫瘤壞死因子-α(TNF-α)蛋白相對表達(dá)量和胰島素受體底物-1(IRS-1)磷酸化情況/±s
組別 重復(fù)次對照高糖高糖+miR-NC高糖+miR-16-mimic F值P值數(shù) 3 3 3 3 TNF-α蛋白相對表達(dá)量0.24±0.02 1.21±0.09 1.17±0.09 0.55±0.04 33.66 0.001 p-IRS-1 Ser307/total-IRS-1 0.16±0.01 0.86±0.06 0.77±0.05 0.44±0.03 21.46 0.001
2.3 上調(diào)miR-16降低視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的SOCS3水平前人研究發(fā)現(xiàn),TNF-α可激活視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的SOCS3信號[16]。本研究考察了miR-16是否會改變高葡萄糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的SOCS3水平。Western blotting數(shù)據(jù)表明,高葡萄糖處理顯著增加了視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的SOCS3水平,而miR-16的過表達(dá)則顯著降低了SOCS3的水平(圖2和表2)。因此miR-16在高葡萄糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中抑制SOCS3信號傳導(dǎo)。
圖2 上調(diào)miR-16降低視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子(SOCS3)水平
表2 各組細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子(SOCS3)蛋白相對表達(dá)量/±s
表2 各組細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子(SOCS3)蛋白相對表達(dá)量/±s
組別對照高糖高糖+miR-NC高糖+miR-16-mimic F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 SOCS3蛋白相對表達(dá)量0.33±0.02 1.67±0.12 1.75±0.13 0.67±0.05 22.14 0.001
2.4 上調(diào)miR-16增強(qiáng)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中IR Tyr1150的磷酸化高血糖癥中SOCS3和TNF-α的增加可通過促進(jìn)IRS-1 Ser307磷酸化并抑制IR Tyr1150的磷酸化來抑制正常胰島素信號[17]。在本研究中,高葡萄糖條件下培養(yǎng)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中IRTyr1150磷酸化水平明顯降低,上調(diào)miR-16則會提高IRTyr1150磷酸化水平(圖3和表3)。結(jié)果表明,胰島素受體是視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中受miR-16調(diào)節(jié)的靶途徑之一,而高水平的miR-16可在高血糖癥中保護(hù)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞。
圖3 上調(diào)miR-16增強(qiáng)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中胰島素受體Tyr1150(IR Tyr1150)的磷酸化
表3 各組胰島素受體Tyr1150(IR Tyr1150)磷酸化/±s
表3 各組胰島素受體Tyr1150(IR Tyr1150)磷酸化/±s
組別對照高糖高糖+miR-NC高糖+miR-16-mimic F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 p-IR Tyr1150/total-IR Tyr1150 1.01±0.07 0.32±0.02 0.35±0.02 0.92±0.07 16.78 0.003
2.5 上調(diào)miR-16在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中增加Akt磷酸化并減少細(xì)胞凋亡本研究考察了miR-16的上調(diào)對視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中Akt的磷酸化的影響。研究發(fā)現(xiàn),高葡萄糖培養(yǎng)降低了Akt磷酸化,而miR-16模擬物處理則可促進(jìn)Akt的磷酸化(圖4A和表4)。
圖4 上調(diào)miR-16在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中增加Akt磷酸化(A)并減少cleaved caspase 3(B)的水平
表4 各組的蛋白激酶B(Akt)磷酸化和活化的胱天蛋白酶-3(cleaved caspase 3)蛋白相對表達(dá)量/±s
表4 各組的蛋白激酶B(Akt)磷酸化和活化的胱天蛋白酶-3(cleaved caspase 3)蛋白相對表達(dá)量/±s
組別 重復(fù)次數(shù)p-Akt/total-Akt cleaved caspase 3蛋白相對表達(dá)量0.73±0.05 0.31±0.02 0.28±0.02 0.86±0.06 33.66 0.001對照高糖高糖+miR-NC高糖+miR-16-mimic F值P值3 3 3 3 0.73±0.05 1.58±0.12 1.44±0.11 0.82±0.06 21.46 0.001
此外,miR-16的過表達(dá)顯著降低了高葡萄糖中cleaved caspase 3的水平(圖4B和表4)。這些結(jié)果表明,miR-16可以通過激活A(yù)kt信號途徑來抑制高葡萄糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
微血管修飾是糖尿病性視網(wǎng)膜病變的重要改變之一。其他工作者已經(jīng)證明,視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞是在糖尿病性視網(wǎng)膜病中受到實質(zhì)影響的關(guān)鍵細(xì)胞類型之一[13,18],但尚不清楚糖尿病性視網(wǎng)膜病的潛在細(xì)胞機(jī)制。糖尿病視網(wǎng)膜病變的新潛在因素是miRNA的調(diào)節(jié)。其他研究表明miR-200b在高葡萄糖條件處理的HUVEC中被下調(diào)[19]。此外,高糖可通過降低HUVEC中miR-146a的表達(dá)來調(diào)節(jié)糖尿病中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生[20]。本研究旨在探討miR-16對高葡萄糖引起的人類視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響。據(jù)報道,miR-16在多種哺乳動物組織中表達(dá),包括腦、心臟、骨骼肌、肝、肺、腎、脾臟等[21-23]。本研究證明了miR-16可在人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá),并且高糖處理可抑制人類視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中miRNA的水平。
其他研究者發(fā)現(xiàn),高葡萄糖會增加視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的TNF-α和SOCS3蛋白水平,TNF-α和SOCS3水平的升高會導(dǎo)致IRS-1 Ser307磷酸化增強(qiáng),以及IR Tyr115磷酸化降低,從而導(dǎo)致胰島素抵抗和凋亡增加[16-17]。敲低 TNF-α?xí)?dǎo)致 IRS-1 Ser307的磷酸化降低,從而促進(jìn)正常的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外,上調(diào)TNF-α可激活視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的SOCS3信號[16]。miR及其靶標(biāo)之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)很復(fù)雜,因為單個miRNA可以與數(shù)百個靶基因結(jié)合,而一個靶基因可以被多個miRNA調(diào)控[24]。各種miRNA靶向不同水平的胰島素信號傳導(dǎo)的分子。不同的miRNA參與信號蛋白的表達(dá),例如胰島素、IRS-1 和 IRS-2和 Akt[25]。本研究證實視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中miR-16的水平升高可抑制TNF-α和SOCS3的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外,上調(diào)miRNA-16可抑制IRS-1 Ser307的磷酸化并促進(jìn)IR Tyr 1150的磷酸化。這表明miR-16可能在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中通過抑制TNF-α和SOCS3信號通路來調(diào)節(jié)下游信號分子如IRS-1 Ser307和IR Tyr 1150的表達(dá),從而發(fā)揮視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。
據(jù)報道,TNF-α水平降低可導(dǎo)致Akt磷酸化增加,從而抑制細(xì)胞凋亡[26]。TNF-α水平升高導(dǎo)致cleaved caspase 3水平升高并引起細(xì)胞凋亡[27]。在高葡萄糖情況下,視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中Akt磷酸化水平的降低會顯著增加促凋亡蛋白如cleaved caspase 3的表達(dá)[16]。因此,本研究考察了miR-16的上調(diào)是否可以增加視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中Akt的磷酸化。研究發(fā)現(xiàn),高葡萄糖培養(yǎng)降低了Akt磷酸化,而miR-16模擬物處理則可促進(jìn)Akt的磷酸化。此外,miR-16的過表達(dá)顯著降低了高葡萄糖中cleaved caspase 3的水平。這些結(jié)果表明,miR-16可以通過激活A(yù)kt信號途徑來抑制高葡萄糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
綜上所述,本研究表明,miR-16通過抑制TNF-α和SOCS3信號通路來抑制IRS-1 Ser307的磷酸化并促進(jìn)IRTyr1150和Akt的磷酸化,從而在抑制胰島素抵抗中發(fā)揮作用,并包括視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)免受高葡萄糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果表明,miR-16是糖尿病性視網(wǎng)膜病的潛在治療靶標(biāo)。