張霓，伍文才，李春燕，陳欣

胃癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤，隨著在分子水平上對胃癌的發(fā)生及進展機制的研究的不斷深入，眾多分子靶向藥物的出現(xiàn)對晚期胃癌的治療提供了良好的前景[1-2]。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，在轉錄后水平調(diào)控基因的表達，影響胃癌細胞的增殖、侵襲、轉移及藥物敏感性等[3]。研究發(fā)現(xiàn)miR-588高表達能顯著抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉移[4]；miR-588在肺鱗狀細胞癌中低表達，與腫瘤分期和淋巴結侵襲呈負相關，miR-588過表達通過靶向GRN可抑制肺鱗狀細胞癌的遷移和侵襲[5]。脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）是信號轉導蛋白，在細胞信號傳導中起重要的作用，Syk在胰腺癌組織中低表達與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關[6]；Syk可抑制胃癌的生長和轉移，誘導胃癌腫瘤細胞凋亡[7]。miR-588和Syk均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關，但miR-588與Syk之間的調(diào)控關系尚不清楚，而且miR-588對胃癌增殖、凋亡的影響及可能的作用機制也不清楚，本研究自2019年1―5月研究miR-588對胃癌增殖、凋亡的影響以及用TargetScan在線軟件預測miR-588是否與Syk存在靶向調(diào)控關系。

1 材料與方法

1.1 材料胃癌細胞SGC-7901、BGC-823和正常胃黏膜細胞GES-1均購自美國ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Sigma公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒、凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；抗體均購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 胃癌細胞SGC-7901、BGC-823、MGC-803和正常胃黏膜細胞GES-1用RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；取胃癌細胞BGC-823和MGC-803，將miR-NC、miR-588、anti-miR-NC和antimiR-588分別轉染至細胞BGC-823和MGC-803中，記為miR-NC組、miR-588組、anti-miR-NC組和antimiR-588組；將anti-miR-588分別與si-NC和si-Syk共同轉染至細胞BGC-823和MGC-803中，記為antimiR-588+si-NC組和anti-miR-588+si-Syk組，轉染后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用于實驗，采取的是瞬時表達。

1.2.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRTPCR）檢測miR-588表達水平 提取各組細胞總RNA，反轉錄成cDNA，按熒光定量試劑盒說明操作，以β-actin為內(nèi)參進行PCR擴增，相對表達量用2?ΔΔCt法計算。

1.2.3 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜，封閉后加入一抗4℃孵育過夜；加入山羊抗兔IgG-HRP（1∶2 000）室溫孵育2 h，顯影，定影，分析蛋白條帶吸光度。

1.2.4 MTT檢測細胞活性 各組細胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒說明操作，酶標儀檢測490 nm處吸光度值。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，PBS漂洗2次，按試劑盒說明操作，加入Annexin VFITC和PI，最后上流式細胞儀檢測。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗 構建Syk野生型和突變型熒光素酶表達載體（WT-Syk和MUT-Syk），將其分別與miR-NC和miR-588共轉染至BGC-823、MGC-803細胞，依據(jù)說明書要求檢測細胞熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-588在細胞 SGC-7901、BGC-823、MGC-803和GES-1中的表達胃癌細胞SGC-7901、BGC-823、MGC-803中miR-588的表達水平高于GES-1細胞[（0.58±0.06）、（0.84±0.08）、（0.97±0.10）比（0.36±0.04），F(xiàn)=89.59，P<0.05]?？梢?，在胃癌株中miR-588高表達。

2.2 抑制miR-588對細胞BGC-823、MGC-803增殖的影響與anti-miR-NC組相比，anti-miR-588組細胞BGC-823、MGC-803中miR-588表達水平降低，cyclin D1蛋白表達水平降低，P21蛋白表達水平升高，胃癌細胞活性降低（P<0.05）（圖1，表1、2）?？梢?，抑制miR-588表達抑制細胞BGC-823、MGC-803的增殖。

圖1 抑制miR-588對細胞BGC-823、MGC-803增殖相關蛋白表達的影響

表1 抑制miR-588對細胞BGC-823增殖的影響/±s

表1 抑制miR-588對細胞BGC-823增殖的影響/±s

注：cyclin D1為細胞周期蛋白D1。

組別細胞活性（OD490 nm）72 h重復次數(shù)miR-588 cyclin D1蛋白P21蛋白24 h 48 h anti-miR-NC anti-miR-588 t值P值1.31±0.13 0.62±0.06 11.81 0.000 6 0 60.83±0.08.42±0.04 11.23 0.000 0.81±0.08 0.22±0.02 17.53 0.000 0.32±0.03 0.93±0.09 15.75 0.000 0.52±0.05 0.37±0.03 6.30 0.000 0.94±0.09 0.49±0.05 1.04 0.323

表2 抑制miR-588對細胞MGC-803增殖的影響/±s

表2 抑制miR-588對細胞MGC-803增殖的影響/±s

注：cyclin D1為細胞周期蛋白D1。

組別anti-miR-NC anti-miR-588 t值P值細胞活性（OD490 nm）72 h 1.31±0.13 0.57±0.06 12.66 0.000重復次數(shù)6 6 miR-588 0.96±0.10 0.35±0.03 14.31 0.000 cyclin D1蛋白0.81±0.08 0.15±0.01 20.05 0.000 P21蛋白0.32±0.03 1.06±0.10 17.36 0.000 24 h 0.52±0.05 0.31±0.03 8.82 0.000 48 h 0.94±0.09 0.42±0.04 12.93 0.000

2.3 抑制miR-588對細胞BGC-823、MGC-803凋亡的影響與anti-miR-NC組相比，anti-miR-588組胃癌細胞BGC-823、MGC-803中Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白表達水平和細胞凋亡率升高（P<0.05）（圖2，表3，表4）。可見，抑制miR-588表達促進細胞BGC-823、MGC-803凋亡。

圖2 抑制miR-588對細胞BGC-823凋亡蛋白表達的影響

表3 抑制miR-588對細胞BGC-823凋亡的影響/±s

表3 抑制miR-588對細胞BGC-823凋亡的影響/±s

注：Bax為Bcl相關X，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2。

Bcl-2蛋白0.75±0.07 0.22±0.02 17.83 0.000 6 6組別anti-miR-NC anti-miR-588 t值P值凋亡率/%7.64±0.75 24.69±2.36 16.87 0.000重復次數(shù)Bax蛋白0.26±0.02 0.83±0.08 16.93 0.000

表4 抑制miR-588對細胞MGC-803凋亡的影響/±s

表4 抑制miR-588對細胞MGC-803凋亡的影響/±s

注：Bax為Bcl相關X，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2。

組別anti-miR-NC anti-miR-588 t值P值凋亡率/%7.64±0.75 26.15±2.76 15.85 0.000重復次數(shù)6 6 Bcl-2蛋白0.75±0.07 0.12±0.01 21.82 0.000 Bax蛋白0.26±0.02 0.95±0.09 18.33 0.000

2.4 miR-588靶向、調(diào)控Syk 將Syk用TargetScan在線軟件預測其可能的作用靶點，結果顯示Syk與miR-588存在結合位點（圖3A）。miR-588與WT-Syk共轉染的胃癌細胞BGC-823、MGC-803熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）（表5）。Western Blot檢測結果（圖3B，表6）顯示，miR-588組BGC-823、MGC-803中Syk蛋白的表達水平顯著miR-NC組；anti-miR-588組胃癌細胞BGC-823、、MGC-803中Syk蛋白的表達水平顯著高于 anti-miR-NC組（P<0.05）?？梢?，miR-588可靶向調(diào)控Syk的表達。

圖3 miR-588靶向調(diào)控Syk：A為Syk與miR-588的互補序列；B為miR-588調(diào)控Syk的表達

表5 雙熒光素酶報告實驗/±s

表5 雙熒光素酶報告實驗/±s

注：Syk為脾酪氨酸激酶。

重復次數(shù)組別MUT-Syk WT-Syk miR-NC miR-588 t值P值6 6 0.99±0.09 1.01±0.10 0.36 0.723 0.96±0.09 0.47±0.04 12.19 0.000

表6 miR-588調(diào)控Syk的表達/±s

表6 miR-588調(diào)控Syk的表達/±s

注：Syk為脾酪氨酸激酶。①與miR-NC組比較，P<0.05。②與anti-miR-NC組比較，P<0.05。

MGC-803 Syk蛋白0.15±0.01 0.03±0.01①0.17±0.01 0.62±0.06②413.28 0.000組別miR-NC miR-588 anti-miR-NC anti-miR-588 F值P值重復次數(shù)6 6 6 6 BGC-823 Syk蛋白0.16±0.01 0.05±0.01①0.15±0.01 0.48±0.05②298.86 0.000

2.5 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-588對細胞BGC-823和MGC-803增殖、凋亡的作用與antimiR-588+si-NC組相比，anti-miR-588+si-Syk組胃癌細胞BGC-823和MGC-803中cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達水平顯著升高，P21、Bax、Syk蛋白的表達水平顯著降低，胃癌細胞活性顯著升高，細胞凋亡率顯著降低（P<0.05）（圖4，表7～10）。可見，抑制Syk表達能逆轉抑制miR-588對細胞BGC-823和MGC-803增殖、凋亡的作用。

圖4 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-588對細胞BGC-823、MGC-803增殖、凋亡蛋白表達的影響

表7 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-588對細胞BGC-823增殖的抑制作用/±s

表7 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-588對細胞BGC-823增殖的抑制作用/±s

注：Syk為脾酪氨酸激酶，cyclin D1為細胞周期蛋白D1。①與anti-miR-NC組比較，P<0.05。②與anti-miR-588+si-NC組比較，P<0.05。

組別anti-miR-NC anti-miR-588 anti-miR-588+si-NC anti-miR-588+si-Syk F值P值72 h 1.31±0.13 0.62±0.06①0.61±0.06 0.98±0.09②83.33 0.000214重復次數(shù)6 6 6 6 Syk蛋白0.13±0.01 0.46±0.04①0.48±0.04 0.29±0.03②153.52 0.000 cyclin D1蛋白0.81±0.08 0.22±0.02①0.21±0.03 0.54±0.05②194.59 0.000 P21蛋白0.32±0.03 0.93±0.09①0.91±0.09 0.65±0.06②94.25 0.000細胞活性（OD490 nm）24 h 0.52±0.05 0.37±0.03①0.35±0.03 0.45±0.04②24.78 0.000 48 h 0.94±0.09 0.49±0.05①0.47±0.05 0.69±0.07②63.86 0.000

表8 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-588對細胞MGC-803增殖的抑制作用/±s

表8 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-588對細胞MGC-803增殖的抑制作用/±s

注：Syk為脾酪氨酸激酶，cyclin D1為細胞周期蛋白D1。①與anti-miR-NC組比較，P<0.05。②與anti-miR-588+si-NC組比較，P<0.05。

組別細胞活性（OD490 nm）重復次數(shù)72 h Syk蛋白cyclin D1蛋白P21蛋白24 h 48 h anti-miR-NC anti-miR-588 anti-miR-588+si-NC anti-miR-588+si-Syk F值P值1.31±0.13 0.57±0.06①0.59±0.06 1.03±0.10②90.91 0.000 6 6 6 6 0.13±0.01 0.58±0.06①0.60±0.06 0.28±0.03②155.78 0.000 0.81±0.08 0.15±0.01①0.13±0.01 0.64±0.06②279.90 0.000 0.32±0.03 1.06±0.10①1.04±0.10 0.55±0.05②138.42 0.000 0.52±0.05 0.31±0.03①0.30±0.03 0.46±0.04②48.92 0.000 0.94±0.09 0.42±0.04①0.43±0.04 0.73±0.07②93.93 0.000

表9 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-588對細胞BGC-823凋亡的促進作用/±s

表9 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-588對細胞BGC-823凋亡的促進作用/±s

注：①與anti-miR-NC組比較，P<0.05。②與anti-miR-588+si-NC組比較，P<0.05。

重復次數(shù)6 6 6 6 Bax蛋白0.26±0.02 0.83±0.08①0.81±0.08 0.56±0.06②101.57 0.000組別anti-miR-NC anti-miR-588 anti-miR-588+si-NC anti-miR-588+si-Syk F值P值Bcl-2蛋白0.75±0.07 0.22±0.02①0.21±0.02 0.47±0.04②214.00 0.000凋亡率/%7.64±0.75 24.69±2.36①24.86±2.37 14.58±1.23②127.18 0.000

表10 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-588對細胞MGC-803凋亡的促進作用/±s

表10 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-588對細胞MGC-803凋亡的促進作用/±s

注：Bax為Bcl相關X，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2。①與anti-miR-NC組比較，P<0.05。②與anti-miR-588+si-NC組比較，P<0.05。

凋亡率/%7.64±0.75 26.15±2.76①26.36±2.47 12.58±1.26②137.57 0.000組別anti-miR-NC anti-miR-588 anti-miR-588+si-NC anti-miR-588+si-Syk F值P值重復次數(shù)6 6 6 6 Bcl-2蛋白0.75±0.07 0.12±0.01①0.14±0.01 0.58±0.06②276.67 0.000 Bax蛋白0.26±0.02 0.95±0.09①0.94±0.09 0.41±0.04②168.53 0.000

3 討論

胃癌的發(fā)病率和死亡率較高，手術結合放化療仍是其治療的主要方法，但化療藥物的不良反應和耐藥性導致患者治療及預后不佳，特定分子靶向藥物具有不良反應少、耐藥率低等優(yōu)點成為治療晚期胃癌的新手段[8]。大量研究表明miRNAs在胃癌中的異常表達與胃癌的進展及預后相關，可作為胃癌早期診斷、預后的標志物和治療的靶點[9]。miR-588在人前列腺癌中上調(diào)表達，與患者預后和存活率密切相關，miR-588下調(diào)表達顯著抑制前列腺癌細胞增殖[10]。而miR-588在乳腺癌中下調(diào)表達，miR-588上調(diào)表達可抑制乳腺癌細胞增殖，增加順鉑化學敏感性[11]。miR-588還參與調(diào)控乳腺癌的PTX耐藥性[12]。王金申利用miRNA芯片技術篩選出在胃癌中差異表達的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-588在胃癌中上調(diào)表達[13]。本研究結果表明，胃癌細胞中miR-588高表達，抑制miR-588表達促進P21、Bax蛋白的表達，抑制cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達；還可抑制胃癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。

Syk是一種潛在的抑癌基因，Syk基因啟動子超甲基化是其沉默的機制之一，Syk的低表達與腫瘤增生及浸潤轉移相關[14]。研究發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白通過逆轉Syk基因啟動子CpG島的甲基化，可抑制喉癌細胞Hep-2的增殖、侵襲遷移[15]；Syk抑制劑可減弱血管平滑肌細胞的增殖和遷移[16]。在胃癌細胞中Syk低表達，高表達抑制胃癌細胞的生長和轉移，誘導胃癌組織腫瘤細胞凋亡[17]；蘆丁聯(lián)合奧沙利鉑通過激活FKN/SYK/p38通路促進胃癌細胞凋亡[18]。此外，Syk還可通過被miRNA調(diào)控影響腫瘤的進展，如Syk是miR-146a的直接靶標，且影響急性髓性白血病小鼠的存活[19]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)miR-588可負調(diào)控Syk表達。

cyclinD1是細胞周期蛋白，cyclinD1高表達促進細胞增殖，而p21是一種新的抑癌基因，高表達抑制細胞增殖[20-21]。Bax和Bcl-2是凋亡相關蛋白，Bax是促凋亡因子，Bcl-2是抗凋亡因子[22]。抑制miR-588表達促進P21、Bax蛋白的表達，抑制cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達；說明抑制miR-588表達抑制胃癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。而同時抑制Syk和miR-588的表達可以促進cyclinD1、Bcl-2蛋白的表達，抑制p21、Bax的表達，說明抑制Syk表達能逆轉抑制miR-588對細胞BGC-823的作用。進一步說明，miR-588可以調(diào)控Syk表達，且miR-588調(diào)控Syk進而通過調(diào)控增殖及凋亡相關蛋白的表達影響胃癌細胞的增殖和凋亡。

綜上所述，miR-588能抑制胃癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，其機制可能與上調(diào)Syk有關。