楊芳，李濟(jì)民，袁偉奇，羅以勤

肺癌作為全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]，嚴(yán)重威脅著人類的生命與健康。肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌最常見的組織學(xué)類型之一，約占40%[2-3]。盡管在肺癌的診治方面取得了不錯(cuò)的進(jìn)步，但是肺腺癌的預(yù)后仍然較差，5年生存率較低[4-5]。所以，尋找更有效的生物學(xué)標(biāo)志物對改善肺腺癌病人的生存和預(yù)后意義深遠(yuǎn)。

隨著基因芯片和RNA測序技術(shù)的發(fā)展，生物學(xué)信息分析方法已經(jīng)被廣泛用于識別與癌癥相關(guān)的生物標(biāo)志物[6]。具有類似表達(dá)模式的基因在功能上可能是相關(guān)的，然而這些方法僅僅是篩選出差異基因，卻忽視了基因間可能的相關(guān)性。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co-expression network analaysis，WGCNA）可以通過構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)來探索不同基因模塊與臨床特征之間的相關(guān)性[7]。

本研究采用WGCNA構(gòu)建肺腺癌基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，識別共表達(dá)模塊，并根據(jù)相應(yīng)臨床信息探討其與基因模塊間的相關(guān)性，篩選出與肺腺癌臨床特征高關(guān)聯(lián)的模塊，最后對這個(gè)模塊基因編碼蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，篩選出樞紐基因核分裂周期蛋白80（nuclear division cycle 80，NDC80）。

1 資料與方法

1.1 差異表達(dá)基因的篩選收集TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome.nih.gov/）中497例肺腺癌癌組織和54例正常肺組織的RNA-seq表達(dá)矩陣及相應(yīng)的臨床信息。利用R語言的DESeq2軟件，對整理好的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，以對數(shù)化表達(dá)變化倍數(shù)（|log2FoldChange|）>1，及校正后的P<0.05作為篩選條件，得到差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），并制作火山圖。

1.2 WGCNA

1.2.1 構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò) 在R語言下運(yùn)行WGCNA包建立基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，剔除離群值，保證此網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性。依據(jù)無尺度網(wǎng)絡(luò)的標(biāo)準(zhǔn)挑選出合適的軟閾值β[8]，并應(yīng)用β將相關(guān)矩陣轉(zhuǎn)為鄰接矩陣，然后將鄰接矩陣轉(zhuǎn)換成拓?fù)渚仃嚕╰opological overlap matrix，TOM），并計(jì)算1-TOM值。接著采用動(dòng)態(tài)剪切樹法進(jìn)行模塊的識別，最小模塊尺寸設(shè)置為20。最后采用層次聚類法對特征向量基因（module eigengene，ME）進(jìn)行聚類分析，同時(shí)制作出模塊樹狀圖。

1.2.2 鑒別與臨床信息相關(guān)的模塊 計(jì)算各模塊的ME與外部每個(gè)臨床特征信息的Pearson相關(guān)系數(shù)及P值，繪制模塊-特征的相關(guān)性熱圖，選取Pearson相關(guān)系數(shù)最高的基因模塊作為目的基因模塊。

1.3 樞紐基因的篩選將目的基因模塊里的所有基因編碼蛋白上傳到STRING數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/），建立PPI網(wǎng)絡(luò)。綜合得分>0.4作為截止標(biāo)準(zhǔn)。并采用Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。最后使用其中的MCODE插件鑒定出樞紐基因（seed基因）。

1.4 樞紐基因的表達(dá)水平與肺腺癌分期、預(yù)后的關(guān)系使用基于TCGA的GEIPA數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析樞紐基因在肺腺癌組織中的表達(dá)水平及其與腫瘤分期、預(yù)后的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)分析均在R（3.5.3）語言上進(jìn)行，其中使用的R語言程序包包括DESeq2 1.26.0、WGCNA 1.69。樞紐基因的表達(dá)差異及其表達(dá)量與分期的關(guān)系采用單因素方差分析法；在肺腺癌中表達(dá)量與預(yù)后的關(guān)系采用Log-rank檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選使用R軟件讀取芯片數(shù)據(jù)得到13 289個(gè)肺腺癌相關(guān)基因，以（|log2FoldChange|）>1，校正后的P<0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到11 904個(gè)DEGs，包括1 112個(gè)上調(diào)基因和792個(gè)下調(diào)基因。DEGs火山圖見圖1。

圖1 肺腺癌差異表達(dá)基因火山圖

2.2 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的建立在R語言下運(yùn)行WGCNA包建立基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)無需剔除離群值，故將1 904個(gè)DEGs全部用于WGCNA?？紤]到無尺度網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及平均連接度的適度保留，本研究選擇β=5構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（相關(guān)系數(shù)等于0.98作為標(biāo)準(zhǔn)），見圖2。最終得到6個(gè)基因模塊，見圖3。

圖2 WGCNA軟閾值（β）的確定：A為不同β下計(jì)算的無尺度擬合指數(shù)分析；B為不同β下計(jì)算的平均連接度；C為當(dāng)β=5時(shí)連接度分布直方圖；D為當(dāng)β=5時(shí)無尺度拓?fù)錂z測

圖3 基因聚類樹狀圖

2.3 鑒別與臨床信息相關(guān)的模塊根據(jù)各個(gè)模塊的特征向量，利用R語言下的WGCNA包分別計(jì)算這些模塊與肺腺癌樣本臨床信息（腫瘤病人的生存時(shí)間、生存狀態(tài)、年齡、性別及腫瘤的TNM分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，棕色模塊與腫瘤病人生存時(shí)間的相關(guān)性較高（P=9e-04），藍(lán)色模塊與腫瘤病人性別的相關(guān)性較高（P=7e-04），見圖4。

圖4 肺腺癌不同臨床特征與模塊特征值相關(guān)性熱圖

2.4 樞紐基因的篩選為了篩選出樞紐基因，本研究將棕色模塊里的128個(gè)基因編碼蛋白和藍(lán)色模塊里的517個(gè)基因編碼蛋白分別上傳到STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。綜合得分>0.4時(shí)，棕色模塊里的基因編碼蛋白構(gòu)建了包含46個(gè)節(jié)點(diǎn)和48個(gè)邊的網(wǎng)絡(luò)，藍(lán)色模塊里的基因編碼蛋白構(gòu)建了包含290個(gè)節(jié)點(diǎn)和2347個(gè)邊的網(wǎng)絡(luò)?？紤]到棕色模塊的PPI網(wǎng)格節(jié)點(diǎn)的度數(shù)普遍≤5，所以藍(lán)色模塊被確定為樞紐模塊。最后使用Cytoscape軟件中的MCODE篩選出藍(lán)色模塊中的核心模塊進(jìn)行后續(xù)分析，并發(fā)現(xiàn)NDC80是其樞紐基因（Seed基因）。

2.5 NDC80基因的表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系。本研究使用GEIPA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證結(jié)果顯示，與正常肺組織樣本相比，NDC80基因的表達(dá)水平在肺腺癌組織中明顯升高（|log2FC|>1，P<0.05），且與肺腺癌的分期相關(guān)（F=3.58，P<0.05）；預(yù)后結(jié)果顯示NDC80基因的高表達(dá)與肺腺癌的總生存期（Overall Survival，OS）較差明顯相關(guān)（HR=1.6，P<0.05），見圖5。

圖5 GEPIA數(shù)據(jù)庫中NDC80基因表達(dá)水平與肺腺癌分期及預(yù)后的關(guān)系：A為NDC80基因表達(dá)水平（P<0.05）；B為NDC80表達(dá)水平與腫瘤分期的關(guān)系（P<0.05）；C為NDC80基因表達(dá)水平與腫瘤總生存期的關(guān)系（P<0.05）

3 討論

本研究利用基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析及蛋白質(zhì)相互作用方法，篩選出肺腺癌差異表達(dá)基因NDC80，并通過GEIPA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證NDC80與肺腺癌分期及預(yù)后的關(guān)系。

NDC80復(fù)合體是一種異四聚體蛋白復(fù)合物，對細(xì)胞有絲分裂至關(guān)重要[9]。復(fù)合體異常表達(dá)會引起染色體異常分離，導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，而染色體不穩(wěn)定是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)共同特征，是腫瘤形成的重要機(jī)制[10]。NDC80作為復(fù)合體的重要組成部分之一，其表達(dá)量在S期至M期顯著升高，且在G2/M期發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[11]。研究表明NDC80基因在肝癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌組織中表達(dá)量均明顯升高，且NDC80基因的高表達(dá)與胰腺癌的預(yù)后有關(guān)[12-15]。Yuan 等[16]篩選了 13 個(gè) GSE數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)NDC80等7個(gè)關(guān)鍵基因與ZW10基因相互作用，參與了肺癌的形成過程。本研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織的NDC80基因的表達(dá)量明顯高于正常肺組織，且與腫瘤的分期相關(guān)。提示NDC80基因可能在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，這與前面的文獻(xiàn)報(bào)道是一致的。其次NDC80基因表達(dá)含量高的肺腺癌病人的總生存期明顯較短，這暗示了NDC80基因有望成為肺腺癌預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，本研究通過WGCNA構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出與肺腺癌的分期及預(yù)后有關(guān)的基因NDC80，這些結(jié)論揭示了NDC80基因可能在肺腺癌病人的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。