馬春蘭，張寶亮，劉曉明

肺癌是全球常見惡性腫瘤，其發(fā)病率、病死率均居惡性腫瘤首位，5年生存率總體偏低，僅17.9%左右，嚴(yán)重影響病人健康，給其家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)[1-2]。有研究表明，非小細胞肺癌（non-small cell lung carcinomas，NSCLC）是肺癌主要類型，早期臨床表現(xiàn)不典型，確診時往往已到中晚期，手術(shù)治療、放化療效果欠佳，易引發(fā)不良反應(yīng)[3-4]。肺腺癌作為NSCLC的主要病理類型之一，早期即可侵犯淋巴管、血管并發(fā)生轉(zhuǎn)移，由于確診往往較晚，多數(shù)只能選擇放化療和藥物治療等手段[5]。因此，尋找有效的抗腫瘤藥物對于治療肺腺癌具有重要價值。雷公藤多苷（tripterygium wilfordii polyglycosidium，TWP）是雷公藤提取物，由于具有抗炎功效，既往常用于治療炎癥性疾病，近來有研究表明，其在口腔癌等腫瘤疾病治療中亦能發(fā)揮不錯的效果[6-7]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/（protein kinase B，AKT）通路是重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可通過聯(lián)系致癌基因與其受體，在癌細胞增殖、凋亡過程中扮演重要角色[8]。但目前TWP對肺腺癌及PI3K/AKT信號通路的影響少有報道。本研究自2019年6―12月通過研究TWP對肺腺癌細胞株A549增殖、凋亡、遷移、血管生成及PI3K/AKT信號通路的影響，以期為TWP治療的肺腺癌臨床應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 主要的試劑與儀器肺腺癌細胞株A549、靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）購自上海冠導(dǎo)生物工程公司，貨號GDCs019499、C4601；TWP購自上海經(jīng)科化學(xué)科技公司，貨號JKBw1779；CCK-8試劑、凋亡檢測試劑盒、結(jié)晶紫購自北京百奧萊博科技有限公司，貨號QN1293-OIR、WE0325-THR、GL0942-PYK；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白試劑盒、磷酸化AKT（p-AKT）抗體、AKT抗體、PI3K抗體、磷酸化PI3K（p-PI3K）抗體、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔購自上海恒斐生物科技有限公司，貨號BC3640、PT0001、bs-5194R-2、bs-0115R-2、bs-0128R-2、bs-5538R-2、M1000110、SR134；RPMI-1640培養(yǎng)基、化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司，貨號ZY-3291R、ZY-11256；酶標(biāo)儀為美國Molecular Devices產(chǎn)品，型號：SpectraMax?iD5；流式細胞儀為美國BD產(chǎn)品，型號BD FACSCanto Ⅱ；顯微鏡為上海炳宇光學(xué)儀器公司產(chǎn)品，型號XDS-10；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司，型號ChemiDocXRS。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) A549細胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基（加胎牛血清）中，放培養(yǎng)箱37℃、5%二氧化碳常規(guī)培養(yǎng)，細胞貼壁融合到80%左右，消化并傳代培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法檢測A549細胞增殖情況 將1×105個/毫升A549細胞每孔以100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加入TWP處理，使其終濃度分別為0 μmol/L（0 μmol/L TWP 組）、20 μmol/L（20 μmol/L TWP組）、40 μmol/L（40 μmol/L TWP組）、80 μmol/L（80 μmol/L TWP組），培養(yǎng)后（24、48、72 h）每孔加CCK-8 10 μL，孵育5 h，酶標(biāo)儀（450 nm）測各孔吸光度（optical density，OD）值，并計算細胞增殖抑制率。

1.2.3 流式細胞儀測A549細胞凋亡情況 A549細胞按1.2.2分組處理，培養(yǎng)48 h收集，消化、洗滌后，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書步驟加400 μL 1×結(jié)合緩沖液，調(diào)整為 1×106個/毫升，加Annexin V-FITC、PI各5 μL，黑暗處孵育20 min，用流式細胞儀進行A549細胞凋亡率檢測。

1.2.4 Transwell法測A549細胞遷移情況 以1×105個/孔的密度將對數(shù)期A549細胞接種于Transwell小室上層，加無血清培養(yǎng)液于上室，加含血清培養(yǎng)液（20%，500 μL）于下室，培養(yǎng)24 h后，未穿膜細胞擦去，乙醇（95%）固定5 min，加結(jié)晶紫染色，20 min后PBS洗滌，用顯微鏡統(tǒng)計6個隨機視野下穿膜細胞數(shù)量，取平均值。

1.2.5 Matrigel膠小管形成實驗檢測血管生成 將96孔培養(yǎng)板、無菌移液槍頭等所有實驗中將接觸MatrigelTM基質(zhì)膠的器材放置在?20℃冰箱中預(yù)冷，-20℃保存的MatrigelTM基質(zhì)膠于4℃冰箱中解凍，待基質(zhì)膠呈液態(tài)時向培養(yǎng)板每孔加入60 μL，再置于4℃10 min，常規(guī)30 min成膠。按1.2.2分組處理A549細胞，培養(yǎng)24 h后收集各組A549細胞培養(yǎng)上清液。將1×105個/毫升HUVEC單細胞懸液以每孔100 μL的體積接種于96孔培養(yǎng)板，分別加入200 μL A549細胞培養(yǎng)上清液，加200 μL RPMI-1640培養(yǎng)液于對照組，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。使用顯微鏡觀察類血管結(jié)構(gòu)形成情況并拍照記錄，使用Image-Pro Plus軟件分析成管數(shù)量。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）測A549細胞中PI3K/AKT通路蛋白表達情況 A549細胞按1.2.2分組處理，培養(yǎng)48 h后收集。蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA蛋白試劑盒進行定量，然后將蛋白樣品電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT和內(nèi)參GAPDH的抗體（1∶500），4℃孵育過夜，洗滌，加入二抗（羊抗兔，用辣根過氧化物酶標(biāo)記，1∶5 000），孵育2 h，化學(xué)發(fā)光顯色，膠片掃描，Tanon 600系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，多組間采用單因素方差分析進行比較，采用LSD-t檢驗進一步兩兩比較。當(dāng)P<0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TWP對A549細胞增殖的影響隨著A549細胞培養(yǎng)時間延長，0 μmol/L TWP組各時間點A549細胞增殖抑制率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），20、40、80 μmol/L TWP組 A549細胞增殖抑制率升高（P<0.05）。同一時間點，隨著TWP濃度的升高，A549細胞的增殖抑制率均升高（P<0.05）。見表1。

表1 不同細胞培養(yǎng)時間不同濃度TWP組A549細胞增殖抑制率比較/±s

表1 不同細胞培養(yǎng)時間不同濃度TWP組A549細胞增殖抑制率比較/±s

注：①與0 μmol/L TWP組相比，P<0.05。②與20 μmol/L TWP組相比，P<0.05。③與40 μmol/L TWP組相比，P<0.05。④與24 h相比，P<0.05。⑤與48 h相比，P<0.05。

72 h組別重復(fù)次數(shù)細胞增殖抑制率/%24 h 48 h 0 μmol/L TWP組20 μmol/L TWP組40 μmol/L TWP組80 μmol/L TWP組F值P值0.00±0.00 13.66±1.08①④⑤21.27±1.85①②④⑤24.63±2.26①②③④⑤246.69<0.001 5 5 5 1 51 0.00±0.000.00±0.00 9.96±0.85①11.43±0.92①④2.77±0.98①②7.21±1.13①②③359.61<0.001 15.84±1.08①②④20.75±1.44①②③④384.42<0.001

2.2 TWP對A549細胞凋亡、遷移的影響隨著TWP濃度的升高，A549細胞的凋亡率均顯著升高，穿膜細胞數(shù)均顯著降低（P<0.05）。見圖1，表2。

圖1 A549細胞遷移：A為0 μmol/L TWP組；B為20 μmol/L TWP組；C為40 μmol/L TWP組；D為80 μmol/L TWP組

表2 不同濃度雷公藤多苷（TWP）組A549細胞凋亡率及穿膜細胞數(shù)比較/±s

表2 不同濃度雷公藤多苷（TWP）組A549細胞凋亡率及穿膜細胞數(shù)比較/±s

注：①與0 μmol/L TWP組相比，P<0.05。②與20 μmol/L TWP組相比，P<0.05。③與40 μmol/L TWP組相比，P<0.05。

9組別0 μmol/L TWP組20 μmol/L TWP組40 μmol/L TWP組80 μmol/L TWP組F值P值重復(fù)次數(shù)5 5 5 5細胞凋亡率/%5.56±0.84 8.78±0.69①10.36±1.13①②21.68±2.11①②③142.367<0.001穿膜細胞數(shù)/個176.64±41.26 122.08±30.72①83.34±19.75①②43.58±13.29①②③20.040<0.001

2.3 TWP對A549細胞誘導(dǎo)血管生成的影響與對照組相比，0、20、40、80 μmol/L TWP組A549細胞誘導(dǎo) HUVEC 成管數(shù)量均升高[（35.85±8.72）、（24.13±6.86）、（15.34±4.66）、（9.15±2.25）個比（6.31±1.49）個，P<0.05]；隨著TWP濃度升高，A549細胞誘導(dǎo)HUVEC成管數(shù)量均降低（P<0.05）。見圖2。

圖2 雷公藤多苷（TWP）對A549細胞誘導(dǎo)血管生成的影響：A為對照組；B為0 μmol/L TWP組；C為20 μmol/L TWP組；D為40 μmol/L TWP組；E為80 μmol/L TWP組

2.4 TWP對A549細胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達的影響隨著TWP濃度升高，A549細胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值均顯著降低（P<0.05）。見圖3、表3。

圖3 雷公藤多苷（TWP）對A549細胞中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶B（AKT）、p-AKT蛋白表達的影響

表3 不同濃度雷公藤多苷（TWP）組A549細胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值比較/±s

表3 不同濃度雷公藤多苷（TWP）組A549細胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值比較/±s

注：①與0 μmol/L TWP組相比，P<0.05。②與20 μmol/L TWP組相比，P<0.05。③與40 μmol/L TWP組相比，P<0.05。

p-AKT/AKT 0.74±0.14 0.53±0.14①0.35±0.09①②0.21±0.05①②③21.135<0.001組別0 μmol/L TWP組20 μmol/L TWP組40 μmol/L TWP組80 μmol/L TWP組F值P值重復(fù)次數(shù)5 5 5 5 p-PI3K/PI3K 0.98±0.16 0.76±0.13①0.55±0.12①②0.36±0.09①②③21.997<0.001

3 討論

中藥治療惡性腫瘤具有多靶點、多方位、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢，目前已成為研究新的抗腫瘤藥物的重要方向[9]。中藥雷公藤是衛(wèi)矛科植物雷公藤的根，具有多種抑制免疫、抗炎、抗腫瘤的有效成分，雖然在臨床應(yīng)用上發(fā)生中毒事件較多，但在腫瘤治療研究中仍有很高的應(yīng)用前景[10]。而TWP是一種脂溶性混合物，從雷公藤中提取，在保留抑制免疫、抗腫瘤等功能的同時，去除了許多毒性成分[11]。增殖、凋亡異常和細胞遷移是腫瘤細胞的基本特征，抑制腫瘤細胞異常增殖、遷移和促進凋亡是評價抗腫瘤藥物的重要指標(biāo)[12]。厲婷等[7]研究表明，TWP可能通過激活PI3K/AKT信號通路來抑制口腔癌KB細胞增殖并促進其凋亡，在口腔癌的治療中可能發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，20、40、80 μmol/L TWP組A549細胞增殖抑制率均隨培養(yǎng)時間延長而顯著升高，同一時間點，A549細胞增殖抑制率、細胞凋亡率均隨TWP濃度升高而顯著升高，A549細胞穿膜細胞數(shù)隨TWP濃度升高而顯著降低，表明TWP能抑制A549細胞增殖、遷移并促進其凋亡，該作用隨TWP濃度升高而增強。

腫瘤生長轉(zhuǎn)移與新生血管生成密切相關(guān)，當(dāng)腫瘤體積超過2 mm3，通過分泌各種促血管生成因子在周圍形成新的血管網(wǎng)，以保證腫瘤內(nèi)部不會因缺血、缺氧而壞死[13]。因此，抑制腫瘤血管生成的藥物已成為如今抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點之一。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，0 μmol/L TWP組A549細胞誘導(dǎo)HUVEC成管數(shù)量較對照組顯著升高，A549細胞誘導(dǎo)HUVEC成管數(shù)量隨TWP濃度升高均顯著降低，表明A549細胞具有誘導(dǎo)血管生成的作用，而TWP在A549細胞誘導(dǎo)血管生成過程中具有抑制作用，且隨TWP濃度是升高，該作用不斷增強。

PI3K/AKT通路是調(diào)控腫瘤進展的重要通路，與腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移及血管生成過程均密切相關(guān)。葉玉蘭等[14]研究表明，塞來昔布、培美曲塞可能通過抑制PI3K/AKT信號通路中AKT蛋白活性，抑制肺腺癌細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。陳晨等[15]研究表明，PI3K/Akt通路與異丙醇誘導(dǎo)下的非小細胞癌細胞的遷移、侵襲過程有關(guān)。郭忠英等[16]研究表明，前列腺癌新生血管生成與PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白關(guān)系密切。Xu等[17]研究表明，PI3K通過AKT調(diào)控細胞周期蛋白D表達，從而影響細胞增殖。Kumar等[18]研究表明，抑制PI3K/AKT介導(dǎo)的AP-1活化可抑制腫瘤生成和血管生成過程。本研究進一步研究TWP對A549細胞PI3K/AKT信號通路的影響，結(jié)果顯示，A549細胞中磷酸化PI3K、AKT蛋白表達水平均隨TWP濃度升高而顯著降低，表明TWP可抑制A549細胞中PI3K、AKT蛋白磷酸化，并推測TWP抑制A549細胞增殖、遷移、促血管生成并誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用機制，可能與抑制PI3K/AKT通路激活有關(guān)。

綜上所述，TWP可抑制A549細胞的增殖、遷移、誘導(dǎo)血管生成行為，并誘導(dǎo)細胞凋亡，這一作用機制可能是通過抑制PI3K/AKT信號通路激活實現(xiàn)的。但具體作用機制還需進一步設(shè)計PI3K/AKT信號通路抑制組進行驗證。