智炎偉

葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma，UM）是原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，易轉(zhuǎn)移，預后差且易致死，目前生存率雖有一定改善但還很低[1]。尋找有效的治療藥物具有重要的臨床意義。小白菊內(nèi)酯（parthenolide，PTL）是從菊科植物中提取出來的倍半萜類化合物，具有抗腫瘤的生物活性，PTL可以抑制胰腺癌Panc-1細胞的增殖并促進其凋亡，同時也影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力[2]。研究發(fā)現(xiàn)PTL能顯著抑制腎癌786-O細胞增殖，誘導786-O細胞發(fā)生凋亡[3]；PTL通過阻滯G1期并調(diào)節(jié)線粒體途徑抑制UM細胞增殖并誘導其凋亡[4]。但小白菊內(nèi)酯是否通過核因子-κB（Nuclear factor κB，NF-κB）信號通路影響葡萄膜黑色素瘤細胞的發(fā)生發(fā)展還尚未清楚，本研究自2019年3―10月研究小白菊內(nèi)酯是否通過NF-κB調(diào)控葡萄膜黑色素瘤細胞的增殖和凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B購自中國科學院上海細胞庫；小白菊內(nèi)酯（分子式C15H20O3，純度>98%，貨號X-028）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；胎牛血清（貨號12003C-500 mL）、RPMI-1640培養(yǎng)基（貨號R1145-500 mL）、胰蛋白酶（貨號T8802）購自美國Sigma公司；MTT試劑盒（貨號C0009）、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin VFITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒（貨號C1065L）、BCA試劑盒（貨號P0012S）、RIPA蛋白裂解液（貨號P0013B）、SDS-PAGE試劑盒（貨號P0012AC）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（Pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）（貨號5108-96-3）、佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯（phorbol12-myristate-13-acetate，PMA）（貨號 P1585）購自美國Sigma公司。Bcl-2相關(guān)X（Bax）（貨號orb146710）、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）（貨號 orb99415）、IkBa（貨號abx104016）、NF-κB（貨號AOB1331a）一抗均購自上海煊翎生物科技有限公司；p-IkBa（貨號bs-18129R-1）抗體購自上海恒斐生物科技有限公司；山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）（貨號ANR02-1）購自上海子起生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%二氧化碳飽和濕度條件下培養(yǎng)，隔天換液一次，待細胞融合至70%左右時，加入胰蛋白酶進行消化傳代，選取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞分組 取對數(shù)生長期細胞，將其接種至96孔板中，并用不同濃度的小白菊內(nèi)酯（0、5、10、20 μg/mL）處理MUM2B細胞，記為0 μg/mL組、5 μg/mL組、10 μg/mL組、20 μg/mL組；用1 μmol/L的PMA作用于WM239細胞培養(yǎng)24 h，記為PMA組；用1 μmol/L的PMA作用于MUM2B細胞培養(yǎng)1 h后再加入10 μmol/L的PDTC培養(yǎng)24 h，記為PDTC組；未經(jīng)任何處理的MUM2B細胞作對照組。10 μg/mL的小白菊內(nèi)酯和1 μmol/L的PMA共同作用于MUM2B細胞，記為10 μg/mL+PMA組。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖 在以上各組細胞培養(yǎng)至24、48、72、96 h時分別加入20 μL（5 g/L）的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μL DMSO振蕩反應(yīng)10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度（OD）值。細胞增殖活性（%）=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。每組重復3次。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化各組細胞，離心收集，PBS漂洗2次，加結(jié)合緩沖液重懸細胞。依據(jù)試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細胞儀檢測激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm處的熒光強度。實驗重復3次。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗（1∶2 000）室溫孵育 2 h，TBST洗滌 3次，每次 10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和βactin條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.00進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小白菊內(nèi)酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B增殖的影響與小白菊內(nèi)酯0 μg/mL組相比，不同濃度小白菊內(nèi)酯處理后分別在24、48、72、96 h時檢測細胞活性，結(jié)果顯示MUM2B細胞活性顯著降低（P<0.05）。可見，小白菊內(nèi)酯抑制MUM2B細胞的增殖。見表1。

表1 小白菊內(nèi)酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B增殖的影響/±s

表1 小白菊內(nèi)酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B增殖的影響/±s

注：①與0 μg/mL組比較，P<0.05。

小白菊內(nèi)酯水平0 μg/mL 5 μg/mL 10 μg/mL 20 μg/mL F值P值細胞活性（OD=490 nm）96 h 1.12±0.09 0.85±0.08①0.47±0.03①0.21±0.03①213.29 0.000重復次數(shù)24 h 0.54±0.05 0.49±0.05①0.41±0.06①0.35±0.04①25.03 0.000 48 h 0.73±0.07 0.56±0.09①0.43±0.04①0.30±0.07①71.06 0.000 9 9 9 9 72 h 0.97±0.08 0.73±0.09①0.46±0.05①0.25±0.04①172.72 0.000

2.2 小白菊內(nèi)酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B凋亡的影響與小白菊內(nèi)酯0 μg/mL組相比，不同濃度小白菊內(nèi)酯組MUM2B細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；Bax表達水平顯著升高，Bcl-2表達水平顯著降低（P<0.05）?？梢?，小白菊內(nèi)酯促進葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B凋亡。見圖1，2和表2。

圖1 小白菊內(nèi)酯對MUM2B細胞凋亡的影響

圖2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測小白菊內(nèi)酯對MUM2B細胞凋亡相關(guān)蛋白表達量的影響

表2 小白菊內(nèi)酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B凋亡的影響/±s

表2 小白菊內(nèi)酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B凋亡的影響/±s

注：Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2；Bax為Bcl-2相關(guān)X。①與0 μg/mL組比較，P<0.05。

小白菊內(nèi)酯水平Bcl-2重復次數(shù) 凋亡率/%凋亡相關(guān)蛋白表達Bax 0 μg/mL 5 μg/mL 10 μg/mL 20 μg/mL F值P值0.91±0.09 0.53±0.07①0.35±0.04①0.20±0.03①217.92 0.000 9 9 9 9 5.54±0.56 13.19±1.65①28.49±3.90①49.36±4.27①368.71 0.000 0.21±0.03 0.36±0.05①0.58±0.07①0.85±0.08①189.88 0.000

2.3 小白菊內(nèi)酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B的NF-κB信號通路的影響與小白菊內(nèi)酯0 μg/mL組相比，小白菊內(nèi)酯10 μg/mL組p-IkBa、NF-κB p65的表達水平顯著降低（P<0.05）；IkBa的表達水平差異無統(tǒng)計學意義。可見，小白菊內(nèi)酯抑制葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B的NF-κB信號通路。見表3，圖3。

表3 蛋白質(zhì)印跡法檢測小白菊內(nèi)酯對MUM2B細胞的核因子-κB（NF-κB）信號通路的影響/±s

表3 蛋白質(zhì)印跡法檢測小白菊內(nèi)酯對MUM2B細胞的核因子-κB（NF-κB）信號通路的影響/±s

注：①與0 μg/mL組比較，P<0.05。

小白菊內(nèi)酯水平0 μg/mL 5 μg/mL 10 μg/mL 20 μg/mL F值P值NF-κB p65 0.93±0.12 0.70±0.08①0.33±0.04①0.21±0.03①170.31 0.000重復次數(shù)9 9 9 9 IkBa 0.97±0.09 0.96±0.14 0.95±0.12 0.98±0.10 0.12 0.951 p-IkBa 0.81±0.11 0.48±0.06①0.29±0.03①0.17±0.02①165.09 0.000

圖3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測小白菊內(nèi)酯對MUM2B細胞的核因子-κB（NF-κB）信號通路的影響

2.4 NF-κB信號通路對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B增殖、凋亡的影響與Control組相比，PDTC組Bax表達水平顯著升高，Bcl-2表達水平顯著降低，細胞活性顯著降低，凋亡率顯著升高（P<0.05）；PMA組Bax表達水平顯著降低，Bcl-2的表達水平顯著升高，細胞活性顯著升高，凋亡率顯著降低（P<0.05）。可見，抑制NF-κB信號通路可抑制葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B增殖，促進細胞凋亡；而NF-κB信號通路激活MUM2B細胞增殖增加，凋亡減少。見表4，圖4。

表4 NF-κB信號通路對MUM2B細胞增殖、凋亡的影響/±s

表4 NF-κB信號通路對MUM2B細胞增殖、凋亡的影響/±s

注：PDTC為吡咯烷二硫代氨基甲酸酯，PMA為佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X。與對照組比較，①P<0.05。

組別對照組PDTC PMA F值P值細胞活性（OD=490 nm）重復次數(shù)Bcl-2 0.93±0.09 0.31±0.03①1.52±0.12①94.68 0.000 9 9 9 24 h 0.51±0.05 0.40±0.04①0.63±0.09①29.29 0.000 48 h 0.71±0.07 0.49±0.06①0.91±0.07①88.93 0.000 72 h 0.94±0.12 0.56±0.08①1.21±0.13①76.37 0.000 96 h 1.09±0.09 0.61±0.08①1.42±0.11①81.55 0.000凋亡率/%5.16±0.56 17.18±1.65①2.53±0.31①525.86 0.000凋亡相關(guān)蛋白表達Bax 0.23±0.05 0.57±0.07①0.12±0.03①145.10 0.000

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測NF-κB信號通路對MUM2B細胞的凋亡相關(guān)蛋白表達量的影響

2.5 小白菊內(nèi)酯通過NF-κB信號通路影響葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B的增殖和凋亡與0 μg/mL組相比，10 μg/mL小白菊內(nèi)酯組Bax表達水平顯著升高，Bcl-2表達水平顯著降低，細胞活性顯著降低，凋亡率顯著升高（P<0.05）；與 10 μg/mL組相比，10μg/mL+PMA組Bax表達水平顯著降低，Bcl-2表達水平顯著升高，細胞活性顯著升高，凋亡率顯著降低（P<0.05）。

可見，NF-κB信號通路激活能夠逆轉(zhuǎn)小白菊內(nèi)酯對葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B的增殖抑制和凋亡促進的作用。見表5，圖5。

表5 小白菊內(nèi)酯通過NF-κB信號通路對MUM2B細胞增殖、凋亡的影響/±s

表5 小白菊內(nèi)酯通過NF-κB信號通路對MUM2B細胞增殖、凋亡的影響/±s

注：PMA為佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X。與0 μg/mL組比較，①P<0.05。 ②與10 μg/mL組相比，P<0.05。

小白菊內(nèi)酯水平細胞活性（OD=490 nm）重復次數(shù)24 h Bcl-2 48 h 72 h 96 h 凋亡率/%凋亡相關(guān)蛋白表達Bax 0.52±0.05 0.39±0.07①0.47±0.09②8.77 0.001 0 μg/mL 10 μg/mL 10 μg/mL+PMA F值P值0.91±0.09 0.40±0.05①0.85±0.08②99.56 0.000 9 9 9 0.71±0.07 0.42±0.06①0.63±0.07②73.81 0.000 0.93±0.12 0.45±0.08①0.81±0.13②83.36 0.000 1.08±0.09 0.46±0.08①0.94±0.10②97.28 0.000 5.31±0.52 26.13±3.18①9.53±1.21②276.09 0.000 0.21±0.03 0.97±0.12①0.30±0.40②123.24 0.000

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測MUM2B細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達

3 討論

葡萄膜黑色素瘤具有高度的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，對人類健康危害極大[5]。近年來發(fā)現(xiàn)部分中藥也可抗黑色素瘤，且不良反應(yīng)輕微[6]。研究發(fā)現(xiàn)PTL可誘導細胞凋亡，抑制非小細胞肺癌細胞增殖和侵襲[7]。PTL通過抑制Bcl-2，NF-κB的表達能抑制宮頸癌Hela細胞株生長與遷移能力[8]；PTL還能抑制人肝癌、前列腺癌細胞的增殖，誘導細胞凋亡[9-10]。本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯可抑制Bcl-2蛋白的表達，促進Bax蛋白的表達；抑制黑色素瘤細胞MUM2B的增殖，促進其凋亡。

NF-κB是真核細胞轉(zhuǎn)錄因子家族，該信號通路的激活常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路的激活與葡萄膜黑色素瘤的不良預后有關(guān)[12]。抑制NF-κB活性可抑制胃癌細胞增殖、侵襲，促進細胞凋亡[13]。PMA是蛋白激酶C的激動劑，活化蛋白激酶C時可使IkBa磷酸化，與NF-κB分離，激活NF-κB信號通路；PDTC是一種抗氧化劑，能阻止IkBa磷酸化，阻止NF-κB活化進入細胞核，從而抑制NF-κB信號通路[14]。本研究用PMA和PDTC處理黑色素瘤細胞MUM2B，發(fā)現(xiàn)PMA作用后細胞活性升高，細胞凋亡減少；PDTC作用后細胞活性降低，細胞凋亡增多。說明抑制NF-κB信號通路抑制MUM2B細胞增殖，促進細胞凋亡；而激活NF-κB信號通路促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。此外，研究發(fā)現(xiàn)PTL可抑制缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）信號傳導和缺氧誘導的大腸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[15]。PTL可通過下調(diào)雷帕霉素/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（mammalian target of rapamycin/phosphoinositide 3 kinese/protein kinase B，mTOR/PI3K/AKT）信號通路來激活自噬和凋亡，從而抑制MDA-T32乳頭狀甲狀腺癌細胞[16]。本實驗結(jié)果表明，PTL能抑制NF-κB信號通路的激活，而激活NF-κB信號通路可逆轉(zhuǎn)PTL對MUM2B細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。提示PTL可能通過NF-κB信號通路影響葡萄膜黑色素瘤的進展。

綜上所述，小白菊內(nèi)酯抑制黑色素瘤細胞MUM2B的增殖，促進其凋亡，可能與NF-κB信號通路相關(guān)，將可為黑色素瘤的治療提供新思路和新靶點。