何瑞婷，朱華，黎理，張淼，謝鳳鳳，黃飄玲，楊雯琪，董雪靜

犁頭草為堇菜科堇菜屬植物長(zhǎng)萼堇菜Viola in?conspicuaBlume.的新鮮或干燥全草，其藥用始載于《履巉巖本草》[1]，生于林緣、山坡草地、田邊及溪旁等處，主要分布在浙江、江西、湖北、湖南、廣東、廣西等地[2]?，幩幟糇g為“窮雷隨咪”，瑤醫(yī)認(rèn)為其具有清熱解毒、散瘀消腫的功效，用于治療淋濁、黃疸、闌尾炎、結(jié)膜炎、疔瘡、癰癤腫毒等[3]。犁頭草在我國(guó)多個(gè)省份都有臨床應(yīng)用，在《廣西中藥志》[4]、《福建藥物志》[5]、《廣東中藥志》[6]、《貴州草藥》[7]等書籍中均有記載。犁頭草作為瑤族、壯族常用藥材，缺乏相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，不能有效控制其質(zhì)量，因此本研究對(duì)犁頭草藥材進(jìn)行了較為系統(tǒng)的質(zhì)量研究，包括性狀鑒別、顯微鑒別，測(cè)定水分、灰分、浸出物含量，通過(guò)薄層色譜法進(jìn)行定性研究，為犁頭草品種鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Ni-U型系統(tǒng)顯微鏡及DS-Ri2型成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）；HistoCore Arcadia C型石蠟包埋機(jī)、RM2235型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、HI1210型攤片機(jī)（上海徠卡公司）；SQP型及BSA224S型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；SX2-4-10N型箱式電阻爐（上海一恒科技有限公司）。

1.1.2 試藥與試劑 夏佛塔苷對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)RP180714，購(gòu)自成都麥德生科技有限公司）；硅膠H板（青島海洋化工有限公司）；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、甲酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其余試劑均為分析純；水為純化水。

犁頭草藥材采自廣西各地，詳細(xì)信息見(jiàn)表1，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為堇菜科植物長(zhǎng)萼董菜Viola inconspicuaBlume.。樣品粉碎后過(guò)2號(hào)篩，備用。

表1 犁頭草樣品信息表

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥材性狀及顯微鑒別 通過(guò)肉眼、放大鏡或解剖鏡，觀察犁頭草干燥全草的根、莖、葉等部位，按形狀、大小、表面、色澤、紋理、質(zhì)地、斷面、氣、味等依次描述其性狀特征；采用石蠟切片、表面制片、粉末制片法，觀察并描述犁頭草根橫切面、葉橫切面及表面、全草粉末的特征[8]。

1.2.2 薄層色譜鑒別 取犁頭草藥材粉末適量，照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法試驗(yàn)，供試品色譜與對(duì)照品色譜應(yīng)在相應(yīng)位置顯相同顏色斑點(diǎn)[9]。

1.2.3 水分、灰分、浸出物含量測(cè)定[10]取犁頭草藥材粉末適量，精密稱定，照水分測(cè)定法（中國(guó)藥典2015年版四部通則0832第二法烘干法）測(cè)定樣品含水量；照灰分測(cè)定法（中國(guó)藥典2015年版四部通則2302）測(cè)定樣品總灰分及酸不溶性灰分；照浸出物測(cè)定法（中國(guó)藥典2015年版四部通則2201熱浸法），以純水為溶劑，測(cè)定樣品浸出物含量。依據(jù)12批藥材的測(cè)定結(jié)果，并從實(shí)際應(yīng)用出發(fā)，擬定檢查限度。

2 結(jié)果

2.1 藥材性狀 本品常皺縮成團(tuán)。根圓柱形，多彎曲，表面有皺紋，土黃色。根狀莖短或無(wú)，可見(jiàn)葉柄殘基。葉基生，呈蓮座狀，黃棕色至灰綠色；展開(kāi)后葉片呈三角形、三角形卵狀或戟形，基部寬心形，先端漸尖，邊緣具鈍鋸齒，兩面無(wú)毛或具短絨毛；葉柄細(xì)，具不明顯狹翅；托葉3/4與葉柄合生，分離部分披針形，通常有褐色銹點(diǎn)。萼片卵狀披針形或披針形，基部附屬物伸長(zhǎng)，長(zhǎng)2～3 mm，末端具缺刻狀淺齒。蒴果橢圓形或三角狀裂開(kāi)，內(nèi)有種子多數(shù)，土黃色。氣微，味辛、微苦。見(jiàn)圖1。

圖1 犁頭草藥材圖

2.2 顯微特征

2.2.1 根橫切面 類圓形。木栓細(xì)胞1～10列，長(zhǎng)方形，常破碎，微木化。皮層占切面二分之一，細(xì)胞類圓形、類方形，有的含草酸鈣簇晶，散有黏液細(xì)胞。維管束外韌型，韌皮部狹窄；木質(zhì)部導(dǎo)管類圓形，單個(gè)散在或數(shù)個(gè)相聚，呈切向排列。見(jiàn)圖2。

圖2 犁頭草根橫切面

2.2.2 葉橫切面 上表皮細(xì)胞1列，類圓形、類方形，細(xì)胞大小不等，排列緊密；下表皮細(xì)胞1列，較?。簧舷卤砥ぞ梢?jiàn)氣孔。柵欄細(xì)胞1～2列，呈圓柱狀，不通過(guò)主脈；海綿組織占較大部分，細(xì)胞較大，排列疏松。主脈維管束外韌型。黏液細(xì)胞類圓形，多見(jiàn)。薄壁細(xì)胞含草酸鈣簇晶。見(jiàn)圖3。

圖3 犁頭草葉橫切面

2.2.3 葉表面片 上表面表皮細(xì)胞垂周壁較平直；下表面表皮細(xì)胞垂周壁波狀彎曲，有的連珠狀增厚，表面有明顯角質(zhì)紋理；上下表面均有氣孔，為直軸式、平軸式。見(jiàn)圖4。

圖4 犁頭草葉表面片：A為上表皮；B為下表皮

2.2.4 粉末 全草粉末棕黃色。草酸鈣簇晶，直徑17～53 μm，棱角較尖或鈍尖。非腺毛單細(xì)胞，偶見(jiàn)多細(xì)胞，長(zhǎng)174～330 μm，表面具角質(zhì)紋理。黏液細(xì)胞類圓形或橢圓形。纖維成束或散在，壁厚，孔溝明顯。導(dǎo)管為螺紋、網(wǎng)紋、具緣紋孔。淀粉粒甚多，常成團(tuán)，單粒類圓形，直徑2～5 μm，臍點(diǎn)點(diǎn)狀、裂縫狀或星狀；復(fù)粒由2～9分粒組成。石細(xì)胞呈類圓形、類方形，壁厚，少見(jiàn)。種皮厚壁細(xì)胞成片，細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)，紋孔明顯。見(jiàn)圖5。

圖5 犁頭草粉末顯微圖

2.3 薄層色譜鑒別

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 取夏佛塔苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取犁頭草粉末0.5 g，加70%甲醇10 mL，超聲處理30 min，冷卻，濾過(guò)，續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.3 薄層色譜條件及結(jié)果 吸取上述溶液各1 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-丙酮-甲酸-水（4∶7∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，晾干，在105℃加熱5 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果表明，供試品色譜與對(duì)照品色譜在相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖6。

圖6 犁頭草及夏佛塔苷的薄層色譜圖

2.4 水分、灰分、浸出物含量測(cè)定12批犁頭草藥材水分、總灰分及酸不溶性灰分、浸出物的測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表2。結(jié)果表明，藥材水分含量在8.72%～11.61%之間；總灰分在10.03%～18.31%之間，酸不溶性灰分在1.17%～5.91%之間；水溶性浸出物含量在29.06%～37.16%之間。從實(shí)際應(yīng)用的角度考慮，初步將犁頭草水分?jǐn)M定為不得過(guò)14.0%；總灰分?jǐn)M定為不得過(guò)20.0%，酸不溶性灰分?jǐn)M定為不得過(guò)8.0%；水溶性浸出物含量擬定為不少于27.0%。

表2 犁頭草水分、灰分和浸出物測(cè)定結(jié)果/%

3 討論

薄層色譜鑒別考察了供試品溶液的制備方法，發(fā)現(xiàn)最佳提取溶劑是70%甲醇，取樣量為0.5 g、溶劑用量為10 mL時(shí)斑點(diǎn)較清晰明顯；考察了甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）、氯仿-甲醇-冰醋酸（10∶1∶0.5）、丙酮-氯仿-甲醇-甲酸（1∶10∶2∶0.5）、乙酸乙酯-甲酸-水（10∶1∶1）、氯仿-丙酮-甲酸-水（4∶7∶1∶1）等展開(kāi)系統(tǒng)，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)最終確定氯仿-丙酮-甲酸-水（4∶7∶1∶1）為展開(kāi)系統(tǒng)；考察了不同點(diǎn)樣量（1、2、5、10 μL），結(jié)果發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣1 μL時(shí)，斑點(diǎn)較清晰；考察了條帶狀、圓點(diǎn)狀點(diǎn)樣方式，發(fā)現(xiàn)圓點(diǎn)狀點(diǎn)樣效果較好；此外，還考察了不同溫濕度、不同廠家及不同類型預(yù)制板對(duì)展開(kāi)的影響，發(fā)現(xiàn)各條件對(duì)展開(kāi)結(jié)果影響不大，方法耐用性較好[11]。

根據(jù)藥材樣品的測(cè)定結(jié)果，考慮到藥材產(chǎn)地在南方，而南方氣候較濕潤(rùn)，因此，將犁頭草藥材水分?jǐn)M定為不得過(guò)14.0%?？偦曳?jǐn)M定為不得過(guò)20.0%，酸不溶性灰分?jǐn)M定為不得過(guò)8.0%，其中LTC-2及LTC-8兩個(gè)批次的樣品總灰分及酸不溶性灰分較高，猜測(cè)是由于藥材采自路邊、田間，泥沙灰塵過(guò)多。浸出物含量擬定為不少于27.0%，經(jīng)過(guò)考察不同方法及不同溶劑，發(fā)現(xiàn)犁頭草藥材水溶性浸出物高于醇溶性浸出物，熱浸法含量高于冷浸法，故采用熱浸法、以純水作為提取溶劑，這與臨床水煎服相吻合。

本研究運(yùn)用性狀鑒別法、顯微鑒別法、薄層色譜法對(duì)收集到的12批瑤藥犁頭草藥材進(jìn)行定性鑒別，并測(cè)定樣品水分、灰分、浸出物含量，初步建立了犁頭草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可用于其質(zhì)量控制。