甘連芳，鐘立璠，黃 凌

（海南醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571199）

哮喘是一種涉及多種炎癥細(xì)胞相互作用、多種細(xì)胞因子參與的慢性氣道炎性疾病[1]。有研究指出，哮喘的發(fā)生與患者存在核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等細(xì)胞因子表達(dá)水平的異常增高密切相關(guān)[2]。氨茶堿具有良好的平喘作用。用此藥治療哮喘可顯著改善患者的肺功能，緩解其氣道的炎癥反應(yīng)[3-4]。白花前胡具有鎮(zhèn)咳、化痰、平喘的功效。此藥是目前臨床上常用的各種鎮(zhèn)咳平喘中成藥的主要有效成分之一[5]。白花前胡戊素（Praeruptorin E，PE）是白花前胡的主要活性成分。藥理學(xué)研究表明，PE可抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)NF-κB的轉(zhuǎn)位及激活，降低IL-6的水平，減輕炎癥反應(yīng)[6]。本文主要是觀察用PE聯(lián)合氨茶堿對卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致哮喘小鼠進(jìn)行治療對其肺組織中NF-κB和IL-6水平的影響。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

PE（上海源葉生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；OVA（Sigma公司生產(chǎn)）；Al(OH)3（Thermo公司生產(chǎn)）；兔抗小鼠NF-κBp65多克隆抗體（Cell Signaling Technology,Inc生產(chǎn)）；二步法免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；蘇木精、伊紅（Sigma公司生產(chǎn)）；TransZol、總RNA快速提取試劑盒（Generay公司生產(chǎn)）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Biosharp公司生產(chǎn)）；qPCR SYBR Green Master Mix（Yeasen公司生產(chǎn)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

將36只6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白組、OVA組、氨茶堿組、氨茶堿+PE小劑量組、氨茶堿+PE中劑量組和氨茶堿+PE大劑量組，每組6只小鼠。對除空白組小鼠外的其余各組小鼠進(jìn)行哮喘造模，為其腹腔注射OVA致敏溶液〔含有OVA和Al(OH)3〕，0.2 mL/次，1次/d，連續(xù)注射7 d。之后使用2%的OVA激發(fā)溶液對其進(jìn)行霧化吸入激發(fā)處理，30 min/次，1次/d，連續(xù)吸入7 d。在對這些小鼠進(jìn)行造模的同時(shí)，為空白組小鼠使用等劑量的生理鹽水。完成上述造模處理后，為氨茶堿組小鼠使用氨茶堿（每次30 mg/kg）進(jìn)行灌胃處理，1次/d。為氨茶堿+PE小劑量組小鼠使用氨茶堿（每次30 mg/kg）和小劑量的PE（每次2.5 mg/kg）進(jìn)行灌胃處理，1次/d。為氨茶堿+PE中劑量組小鼠使用氨茶堿（每次30 mg/kg）和中劑量的PE（每次10 mg/kg）進(jìn)行灌胃處理，1次/d。為氨茶堿+PE大劑量組小鼠使用氨茶堿（每次30 mg/kg）和大劑量的PE（每次40 mg/kg）進(jìn)行灌胃處理，1次/d。各組小鼠均連續(xù)灌胃7 d，然后對其進(jìn)行剖檢。

1.3 對各組小鼠進(jìn)行病理切片檢查

對各組小鼠的肺組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片處理，采用蘇木精-伊紅染色法對切片進(jìn)行染色，在400倍的顯微鏡下觀察切片中肺組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)。

1.4 采用免疫組化法檢測各組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的表達(dá)

將各組小鼠的肺組織浸泡在4%的中性甲醛溶液中固定72 h，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟、水化、封閉處理。在切片中加入兔抗小鼠NF-κBp65多克隆抗體孵育過夜，然后進(jìn)行顯色、封片處理。觀察切片中的NF-κBp65蛋白，用專業(yè)的圖像分析軟件計(jì)算各組小鼠肺組織中NFκBp65蛋白的陽性表達(dá)率。

1.5 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測各組小鼠肺組織中NF-κBp65mRNA和IL-6mRNA的表達(dá)

提取各組小鼠肺組織中的總RNA，使用微量核酸檢測儀測定RNA的純度和濃度，取合格的總RNA樣品進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄合成，并置于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析儀中進(jìn)行擴(kuò)增處理。引物設(shè)計(jì)如 下：NF-κBp65 F：5’-AGGATTTCGATTCCGCTACG-3’，R：5’-CCTGGTCCTGTGTAGCCATT-3’；IL-6 F:5'-TGTAGTGAGGAACAAGCCAGAG-3'，R：5’-TACATTGCCGAAGAGCC-3’；Actin F：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’，R：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’。循環(huán)結(jié)束后，繪制溶解曲線。獲得NF-κBp65、IL-6和Actin的熒光域值循環(huán)數(shù)(Ct值)后，計(jì)算NFκBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件對本研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 接受相應(yīng)處理后各組小鼠肺組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)

接受相應(yīng)處理后，各組小鼠肺組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)如下：1）空白組小鼠：小鼠支氣管周圍細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的形態(tài)正常，無形態(tài)學(xué)改變，結(jié)構(gòu)清晰；2）OVA組小鼠：小鼠支氣管壁周圍出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤，其支氣管壁明顯增厚；3）氨茶堿組小鼠：小鼠支氣管壁周圍出現(xiàn)輕微的炎性細(xì)胞浸潤，其支氣管壁輕微增厚；4）氨茶堿+PE小劑量組小鼠：小鼠支氣管壁周圍出現(xiàn)輕微的炎性細(xì)胞浸潤，其支氣管壁結(jié)構(gòu)幾乎無改變；5）氨茶堿+PE中劑量組小鼠：小鼠支氣管壁周圍出現(xiàn)輕微的炎性細(xì)胞浸潤，其支氣管壁結(jié)構(gòu)無改變；6）氨茶堿+PE大劑量組小鼠：小鼠支氣管壁周圍無炎性細(xì)胞浸潤，其支氣管壁結(jié)構(gòu)無改變。詳見圖1。

圖1 接受相應(yīng)處理后各組小鼠肺組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)

2.2 各組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的表達(dá)情況

與空白組小鼠相比，OVA組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)率較高，P＜0.05。與OVA組小鼠相比，氨茶堿組小鼠接受治療后其肺組織中NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)率較低，P＜0.05。接受治療后，氨茶堿+PE小劑量組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)率低于氨茶堿組小鼠，P＜0.05；氨茶堿+PE中劑量組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)率低于氨茶堿+PE小劑量組小鼠，P＜0.05；氨茶堿+PE大劑量組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)率低于氨茶堿+PE中劑量組小鼠，P＜0.05。詳見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的表達(dá)情況

2.3 各組小鼠肺組織中NF-κBp65mRNA和IL-6mRNA的表達(dá)情況

與空白組小鼠相比，OVA組小鼠肺組織中NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均較高，P＜0.05。與OVA組小鼠相比，氨茶堿組小鼠接受治療后其肺組織中NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均較低，P＜0.05。接受治療后，氨茶堿+PE小劑量組小鼠肺組織中NFκBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均低于氨茶堿組小鼠，P＜0.05；氨茶堿+PE中劑量組小鼠肺組織中NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均低于氨茶堿+PE小劑量組小鼠，P＜0.05；氨茶堿+PE大劑量組小鼠肺組織中NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均低于氨茶堿+PE中劑量組小鼠，P＜0.05。詳見圖3。

圖3 各組小鼠肺組織中NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)情況

3 討論

PE是白花前胡的主要活性成分，具有良好的抗炎作用[6]。藥理學(xué)研究表明，PE可抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而可起到減輕炎癥反應(yīng)的作用[7-8]。本研究的結(jié)果顯示，接受治療后，氨茶堿+PE小劑量組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)率、NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均低于氨茶堿組小鼠，P＜0.05；氨茶堿+PE中劑量組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)率、NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均低于氨茶堿+PE小劑量組小鼠，P＜0.05；氨茶堿+PE大劑量組小鼠肺組織中NFκBp65蛋白的陽性表達(dá)率、NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均低于氨茶堿+PE中劑量組小鼠，P＜0.05。這與相關(guān)研究的結(jié)果相符[9-10]。這表明，與單用氨茶堿、用小劑量的PE聯(lián)合氨茶堿、用中劑量的PE聯(lián)合氨茶堿相比，用大劑量的PE聯(lián)合氨茶堿對OVA致哮喘小鼠進(jìn)行治療的效果較好，可顯著降低其肺組織中NF-κB和IL-6的表達(dá)水平，減輕其氣道的炎癥反應(yīng)。