裴徐梨，荊贊革,2，唐 征，馮鵬宇

(1 昆明學院 農學與生命科學學院，昆明 650214；2 溫州科技職業(yè)學院 農業(yè)與生物技術學院，浙江溫州 325006)

miRNA是一類重要的內源性單鏈小分子RNA[1]。前人研究表明，miRNA及其靶基因在花粉發(fā)育和育性調控中具有重要的作用[2]。例如，miR156可通過調節(jié)SPL轉錄因子的表達來影響擬南芥雄配子的產(chǎn)生[3]；miR159a-1能夠抑制MYB基因的轉錄水平來調控花芽分化和植株育性[4]；miR172與其靶基因(AP2類基因)共同調節(jié)擬南芥的開花時間和器官形成[5]。近年來，利用高通量測序技術很多與植物育性相關的miRNA已被成功鑒定出來[6-8]。

青花菜雜種優(yōu)勢非常明顯。細胞質雄性不育系以其育性穩(wěn)定、開花能力優(yōu)良和雜交率高等優(yōu)點已被廣泛應用于青花菜雜交育種體系中。本研究利用Illumina測序技術構建了青花菜細胞質雄性不育系和保持系的sRNA文庫，共鑒定到47個差異表達miRNA。同時，通過qRT-PCR技術檢測了部分miRNA及其靶基因的表達特征，本研究結果為進一步探討miRNA調控青花菜育性提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以回交8代以上的青花菜Ogu細胞質雄性不育系WN12-95A(MS)及其保持系WN12-95B(FS)為試驗材料。于花期采集長度小于2 mm的不育系和保持系花蕾用于高通量測序。采集不育系和保持系3個不同時期花蕾(長度< 2 mm、2～4 mm、> 4 mm)以及保持系大于4 mm花蕾的不同部位(花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊)用于qRT-PCR分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 青花菜sRNA文庫構建和miRNA的鑒定從質量合格的總RNA中分離和純化得到長度合適的small RNA進行文庫構建，而后進行高通量測序。采用SOAP2將過濾得到高質量clean read比對到青花菜轉錄組參考序列[8]。已知miRNA的鑒定通過miRDeep2軟件比對到miRBase數(shù)據(jù)庫；新型miRNA的預測則通過堿基延伸未比對上的序列，再通過MIREAP軟件進一步的篩選。

1.2.2 青花菜不育系和保持系差異miRNA的篩選將miRNA表達水平進行歸一化處理，使用歸一化的數(shù)據(jù)計算Fold Change(FC)和P值。差異表達miRNA的篩選以|log2(FC)| ≥ 1，P< 0.05 作為標準。

1.2.3 青花菜差異miRNA的靶基因預測及功能注釋使用psRNA Target軟件進行潛在靶基因的預測[9]，錯配小于4的基因被選為候選靶基因。同時基于 sRNA 和 mRNA 測序數(shù)據(jù)，采用關聯(lián)分析的方法鑒定雄性不育相關差異表達基因[10]與差異miRNA的關聯(lián)網(wǎng)絡。

1.2.4 實時熒光定量分析差異miRNA及靶基因的表達特性miRNA及總RNA的提取和反轉錄均使用TaKaRa公司試劑盒。實時熒光定量參照Xu等的方法[11]，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa公司)在ABI 7500(Applied Biosystems公司)上運行。miRNA反應程序為：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40個循環(huán)。靶基因反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，40個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCt法來計算。以U6 和actin基因分別作為miRNA及其靶基因的內參基因。試驗所用引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物信息

2 結果與分析

2.1 青花菜不育系和保持系sRNA數(shù)據(jù)分析

構建了青花菜雄性不育系和保持系花蕾的2個sRNA文庫，共得到47.88 M原始數(shù)據(jù)(表2)。過濾掉經(jīng)接頭序列和低質量序列后，分別獲得15.44 M(不育系)和24.26 M(保持系)的clean reads，分別占Reads總數(shù)的76.6%和87.5%。過濾后序列的總堿基對不育系和保持系分別為351 525 505 bp和535 664 137 bp。

2.2 青花菜不育系和保持系miRNA的鑒定

青花菜不育系和保持系中共鑒定到69個家族中的181個已知miRNA，包括138個保守miRNA和43個非保守miRNA。其中miR156家族成員數(shù)最多，為10個，而大部分保守miRNA家族僅發(fā)現(xiàn)1個成員。miR403和miR167表達豐度分別為351 989和 278 824，在2個樣品中呈現(xiàn)高表達；而miR1520、miR529和miR535的表達豐度均較低。

青花菜不育系和保持系中共鑒定到8個新型miRNA(表3)，其中1個新型miRNA在保持系中特異性表達。對這些新型miRNA的基本信息進行分析，結果顯示它們的最小自由能(the minimum free energy，MFE)為-40.70～-24.10 kcal/mol，長度介于21到25 nt。

表3 青花菜不育系和保持系中鑒定的新型miRNA

2.3 青花菜雄性不育相關miRNA的鑒定

通過比較2個文庫中的miRNA的表達量，結果(圖1)發(fā)現(xiàn), 43個已知miRNA和4個新型miRNA在青花菜不育系和保持系中差異表達。其中，24個已知miRNAs和4個新型miRNAs表達上調，其余miRNA表達下調；6個差異表達miRNA的差異倍數(shù)大于8；2個差異miRNA只在不育系中表達，7個差異miRNA為保持系所特有。

A.已知miRNA； B.新型miRNA圖1 青花菜不育系(MS)和保持系(FS)差異miRNA表達量比較分析Fig.1 Comparative relative expressions of differentially expressed miRNAs in male sterile line (MS) and maintainer line (FS) of broccoli

2.4 青花菜差異表達miRNA的靶基因預測

利用psRNA Target軟件共預測到188條靶序列。通過進一步的靶基因功能分析，發(fā)現(xiàn)其中一些靶基因是雄性不育發(fā)生和花粉發(fā)育過程中的轉錄因子。例如AP2-like轉錄因子、鋅指結構域蛋白基因、激素響應因子(auxin response factors家族，ARF)和SPL(squamosa promoter binding protein-like)結合蛋白基因等。同時，一些靶基因編碼的磷酸甘油酸激酶、三角狀五肽重復蛋白質、油質蛋白、谷氨酸脫羧酶和γ-微管蛋白復合體等都是該過程中重要的生物蛋白。

圖2顯示，差異表達miRNA的靶基因經(jīng)GO注釋為17個生物學過程類目，10個細胞成分類目和11個分子功能類目，表明這些靶基因參與了多種代謝和發(fā)育過程。KEGG注釋結果(圖3)將靶基因分為23個代謝途徑，其中“植物病原菌的相互作用”(ko04626)、“N-糖鏈的合成”(ko00510)和“線粒體的脂肪酸延伸”(ko00062)為靶基因參與最多的途徑。COG注釋結果(圖4)可將靶基因分為19個不同的功能類。其中屬于“一般功能預測”類群的靶基因數(shù)最多(圖4)。

圖2 青花菜差異表達miRNA靶基因的GO注釋Fig.2 Gene ontology analysis for target genes of differentially expressed miRNAs in broccoli

圖3 青花菜差異表達miRNA靶基因的KEGG注釋Fig.3 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analysis for target genes of differentially expressed miRNAs in broccoli

圖4 青花菜差異表達miRNA靶基因的COG注釋Fig.4 Clusters of orthologous groups of proteins analysis for target genes of differentially expressed miRNAs in broccoli

2.5 青花菜雄性不育相關miRNAs與mRNAs的關聯(lián)分析

將本實驗室的青花菜sRNA 和 mRNA數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析，鑒定到2個關聯(lián)的miRNA-mRNA對(miR859-1/T2-Unigene_BMK.21608和miR5174e-1/T2_Unigene_BMK.31772)(圖5，A)。分析發(fā)現(xiàn)2個miRNA均負向調控相應的靶基因(圖5，B)。對miRNA的靶基因進行注釋發(fā)現(xiàn)，miR859-1靶向的花粉外壁蛋白基因(T2/Unigene_BMK.21608)和miR5174e-1調控的氨基酸通透酶基因(T2_Uni-gene_BMK.31772)均可參與雄性不育的發(fā)生過程。

圖5 青花菜雄性不育相關miRNAs與mRNAs的關聯(lián)分析(A)及表達特性(B)Fig.5 The association analysis (A) and expression patterns (B) of CMS-related miRNAs and mRNAs in broccoli

2.6 青花菜育性相關miRNA表達特性分析

選取青花菜育性相關的8個miRNA(5個已知miRNA和3個新型miRNA)進行熒光定量PCR分析，在花蕾不同時期的表達模式分析結果(圖6，Ⅰ)顯示，miR159a-1、miR164a-1、miR319a-1和miRn11在不育系(A1)中的表達量高于保持系(B1)。其中，miR164a-1、miR319a-1和miRn11的表達水平隨著不育系花蕾的發(fā)育逐漸降低，但在保持系花蕾中的表達量隨著花蕾發(fā)育呈現(xiàn)上升趨勢；miR159a-1的表達量在不育系和保持系花蕾發(fā)育初期均最高，以后表達量逐漸下降。此外，miR397a-2、miR168a-4、miRn4和miRn16在保持系中上調表達，但表達模式各有差異。miRn4在不育系花蕾中的表達量逐漸增加，在保持系中表達趨勢相反；其余3個miRNA在不育系和保持系中的表達趨勢一致。同時，進一步比較靶基因和miRNA的表達特性后，結果發(fā)現(xiàn)miRNA與其對應的靶基因基本呈現(xiàn)相反的表達趨勢。

A. 不育系;B. 保持系;1、2、3分別代表 < 2 mm、2～4 mm和 > 4 mm的花蕾圖6 青花菜miRNA及其對應靶基因在不同發(fā)育時期花蕾和不同部位中的表達特征A. Male sterile line; B. Maintainer line; 1, 2 and 3. were buds with length of < 2 mm, 2-4 mm, and > 4 mm, respectivelyFig.6 Expression characteristics of miRNAs and their corresponding targets in different developmental stages and different parts of flower buds in broccoli

由圖6，Ⅱ可以看出，miR168a-4、miR159a-1、miR164a-1和miRn4在青花菜不同部位均有表達,且表達量差異不大；miR319a-1在雄蕊中的表達量最高，在花萼、花瓣和柱頭中的表達量降低；miRn11在花萼中的表達量明顯高于其他組織，而與之相反，miRn16在花萼中的表達量極低；miR397a-2在雄蕊中表達量最高，但在花瓣和柱頭中幾乎不表達，推測其具有組織特異性。

3 討 論

miRNA的基本特征分析是了解其調控作用的基礎。本試驗中sRNA的長度分析結果符合植物miRNA的特征。然而，青花菜的23 nt miRNAs的數(shù)量高于21 nt miRNAs，表明這些miRNA調控育性的機制可能具有其特點。近年來，大量研究表明已知miRNA通常具有較高的表達水平，且其功能在植物進化中較保守。而新型miRNA的表達量明顯低于保守miRNA。在本研究中鑒定到的青花菜miRNA也存在此現(xiàn)象。

3.1 青花菜表達上調miRNA的調控機制探討

植物雄性不育的發(fā)生是一系列相關miRNA參與的結果。本研究共鑒定到29個上調表達的miRNA，其中miR397a-2靶向laccase-like轉錄因子。該轉錄因子能夠調控植物發(fā)育過程中油菜素內酯的信號轉導。油菜素內酯作為雄性不育發(fā)生的重要因子，其含量升高可降低擬南芥花粉的釋放效率[12]。此外，上調表達水稻OsLAC(laccase-like gene)基因可導致部分雄性不育[13]。本試驗中miR397a-2在青花菜不育系中的表達量顯著低于保持系，因此推測miR397a-2可能是通過調控LAC基因的表達來參與青花菜的雄性不育發(fā)生。

激素響應因子(ARF類基因)在大豆中可以通過結合激素響應啟動子調控花粉發(fā)育。miR395的靶基因中就有ARF3(auxinresponsefactor3)，且該miRNA在保持系中的表達量高出不育系4.7倍。因此，推測miR395能夠通過調節(jié)激素介導的信號轉導來影響青花菜的育性。

3.2 青花菜表達下調miRNA的調控機制探討

miRNA與其靶基因相互作用來調控花粉發(fā)育[14]。miR156通過介導SBP-box基因來調控花粉發(fā)育。在擬南芥中，過表達SPL可以保護花粉育性[3]。青花菜miR156在不育系中高表達，推測miR156可能通過調控SBP-box基因的表達來影響其育性。三角狀五肽重復蛋白(pentatricopeptide repeat gene,PPR)在RNA編輯中具有重要功能。miR158、miR400、miR859和miR5067均靶向PPR基因，且在青花菜保持系中的表達量低于不育系?，F(xiàn)有研究表明PPR基因可使蘿卜育性恢復[15-18]。因此，我們推測miRNA抑制雄性不育相關的PPR基因的表達是青花菜雄性不育發(fā)生的可能原因之一。

Ca2+運輸功能障礙可影響花粉發(fā)育。鈣/鈣調依賴性蛋白激酶是鈣離子流入細胞的調節(jié)器[19]。預測靶向鈣/鈣調依賴性蛋白激酶基因的miR399在青花菜保持系中下調表達，推測其在不育系中的高表達引起花粉發(fā)育過程中鈣穩(wěn)態(tài)的失調和Ca2+介導的信號通路的減弱，從而導致雄性不育的發(fā)生。