王西成，吳偉民，王 博，王壯偉，錢亞明，閆莉春

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，南京 210014)

葡萄是一種重要的經(jīng)濟作物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。中國是葡萄生產(chǎn)大國，葡萄栽培面積和產(chǎn)量分居世界第3和第1位[1]。色澤是果實外觀品質(zhì)的重要指標(biāo)，更是葡萄果實成熟程度的重要評價依據(jù)，直接決定著葡萄的商品價值和市場競爭力?；ㄉ帐且活悘V泛存在于植物體內(nèi)的水溶性色素，是決定葡萄果實顏色的主要物質(zhì)，可通過苯丙烷代謝途徑和類黃酮途徑合成，存在于表皮細(xì)胞的液泡中，伴隨著葡萄果實的發(fā)育與成熟，果實中花色苷會逐漸積累，進而使葡萄呈現(xiàn)出不同的顏色[2-3]。

花色苷的合成不僅受遺傳因素影響，同時還受到環(huán)境和理化因素的影響，如光照[4]、溫度[5]、水分[6]、植物生長調(diào)節(jié)劑[7-8]等。遺傳因素決定了花色苷合成的種類和時期，而環(huán)境因素則會影響花色苷生物合成的速率和積累量[9-10]。一般認(rèn)為葡萄果實中花色苷的合成主要包括苯丙氨酸代謝、類黃酮代謝、二氫黃酮醇生成花色素、花色素骨架合成后的修飾，以及花色苷合成后在液泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運和匯集5個階段。而花色苷生物合成相關(guān)基因主要包括結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因，結(jié)構(gòu)基因可編碼直接與花色苷合成和轉(zhuǎn)運貯藏相關(guān)的酶，如：苯丙氨酸裂解酶基因(PAL)、查爾酮合成酶基因(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶基因(CHI)、黃烷酮-3-羥化酶基因(F3H)、黃烷酮3′羥化酶基因(F3′H)、黃烷酮3′5′羥化酶基因(F3′5′H)、二氫黃酮醇還原酶基因(DFR)、無色花色素雙加氧酶基因(LDOX)、3-O-類黃酮葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(UFGT)、甲基轉(zhuǎn)移酶基因(OMT)等[11]；調(diào)節(jié)基因可控制花色苷生物合成過程中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的時空特異表達(dá)，進而影響花色苷生物合成的強度和模式，如：轉(zhuǎn)錄因子基因MYB、bHLH等[12-13]。在花色苷合成過程中，充足的光照可促進UFGT基因的上調(diào)表達(dá)，進而促進葡萄果皮中花色苷的合成；而遮光處理則會抑制UFGT基因的表達(dá)，并最終影響花色苷的合成[14]。MYB是調(diào)控花色苷合成的重要轉(zhuǎn)錄因子，可在葡萄果皮中特異性表達(dá)[13-14]。枝條環(huán)剝和ABA處理均可通過促進MYBA1和MYBA2轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)，進而調(diào)控UFGT基因的上調(diào)表達(dá)，誘導(dǎo)花色苷的積累[15-16]。同時，MYB也可通過與bHLH互作來實現(xiàn)對果實花色苷合成的調(diào)控[17]。

套袋是優(yōu)質(zhì)葡萄生產(chǎn)過程中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它不僅可以防止昆蟲、鳥類等對果實的危害，同時還可有效阻礙病菌的侵染，大幅降低病果發(fā)生幾率[18]。同時，套袋還能避免灰塵、農(nóng)藥等對果實的污染，保持果面的清潔和果粉的完整，有利于果實外觀品質(zhì)的提高[19]。此外，由于套袋改變了果實生長發(fā)育期的溫度和光照條件，因此也會對果實的產(chǎn)量和內(nèi)在品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響[20-21]。

目前，有關(guān)套袋對葡萄果實著色影響的研究盡管已有報道，但其影響果實著色的深層機理仍不清楚[22-23]。為進一步明確果實套袋對葡萄果實中花色苷合成及相關(guān)基因表達(dá)的影響，本研究以‘紫金紅霞’葡萄為試材，考察5種不同類型果袋對果皮中花色苷合成及相關(guān)基因表達(dá)影響，以期在轉(zhuǎn)錄水平上探討套袋影響葡萄花色苷合成的分子機理，同時也為‘紫金紅霞’葡萄生產(chǎn)中果袋的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年6-8月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溧水植物科學(xué)基地內(nèi)進行。供試材料為長勢基本一致的3年生‘紫金紅霞’葡萄，常規(guī)栽培管理。供試果袋包括白色紙袋、無紡布-白紙雙層袋(雙層袋)、綠色紙袋、藍(lán)色紙袋和棕色紙袋。

1.2 材料處理與樣品采集

2020年6月12日，選取生長發(fā)育相對較為一致的葡萄進行5種果袋套袋處理，不套袋為對照(CK)。試驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，單株小區(qū)，每個處理3株葡萄。分別于套袋后40、50和60 d時各取樣一次，直至果實完全成熟。每次從每個小區(qū)葡萄果穗的上、中、下部位隨機取樣20粒。樣品采集后分兩部分保存，一部分冰盒帶回實驗室，用于單果重、果粒縱橫徑、可溶性固形物(total soluble solid, TSS)、可滴定酸(titrate acid, TA)、花色苷含量，以及果實色澤指標(biāo)的測定；另一部分用手術(shù)刀片剝?nèi)」?，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 果實品質(zhì)測定

單果重量用電子天平稱量，果實的縱徑和橫徑用游標(biāo)卡尺測量，據(jù)此計算果形指數(shù)(縱徑與橫徑的比值)?？扇苄怨绦挝锖坎捎肞AL-1手持式糖度計(ATAGO)測定，可滴定酸含量采用酸堿滴定法測定。葡萄果實赤道(中緯線)處對稱4面的果面色澤采用Color Quest XT色差計Hunter Lab表色系統(tǒng)進行測定[24]，主要包括L*(亮度)、a*(紅綠色差)、b*(黃藍(lán)色差)。然后，進一步利用色差計所測值計算出色澤飽和度(chroma，C*)、色調(diào)角(hue angle,h°)和葡萄果實色澤指數(shù)(color index of red grape,CIRG)。其中，C*=(a*2+b*2)1/2，h°=arctan(b*/a*)，CIRG=(180-h°)/(L*+C*)。葡萄果實色澤指數(shù)評價果實色澤的標(biāo)準(zhǔn)為：CIRG<2 為黃綠色，26為紫黑色[25]。

1.4 花色苷含量測定

果皮總花色苷的提取參考Jia等[26]的方法并加以改進：分別取不同發(fā)育時期、不同處理的果皮樣品，液氮研磨成粉末，稱取1.0 g樣品粉末，加入10 mL含1%鹽酸的甲醇溶液，4 ℃黑暗條件中靜置24 h，10 000 r/min高速離心10 min，沉淀反復(fù)浸提3次，合并上清液即得果皮總花色苷提取液?；ㄉ蘸康臏y定參考王小青等[27]的方法進行，首先利用分光光度計分別測出530和650 nm處的吸光度值D530和D650，然后根據(jù)公式計算出葡萄果皮中花色苷含量。其中，花色苷含量(mg·g-1)=(D530-0.25×D650)×提取液總體積/0.0462/果皮鮮重。

1.5 基因表達(dá)分析

本研究選擇了部分花色苷合成相關(guān)基因用于表達(dá)分析?？俁NA的提取采用上海浦迪生物科技有限公司生產(chǎn)的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒進行，操作方法參考說明書進行，并利用瓊脂糖凝膠電泳對RNA質(zhì)量進行檢測。以總RNA為模板，利用MonScriptTMRTⅢ All-in-One Mix with dsDNase試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

Real-Time PCR引物設(shè)計：MYBA1和CHS1基因引物參考張雷等[22]，F(xiàn)3′H、DFR和LDOX基因引物參考Jeong等[28]，UFGT基因引物參考柳巧禛等[29]，內(nèi)參基因KyActin1引物參考Kobayashi等[12]，引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成(表1)。

Real-Time PCR反應(yīng)體系為20 μL：MonAmpTMSYBR Green qPCR Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上游和下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序為兩步法：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火+延伸30 s，40個循環(huán)。每個循環(huán)第2步進行熒光數(shù)據(jù)讀取。每個樣品設(shè)置3 次重復(fù)，相關(guān)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進行處理，以確定目的基因的相對表達(dá)水平。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、標(biāo)準(zhǔn)曲線等利用Excel 2016軟件進行計算，單因素方差分析使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 果袋類型對葡萄果實品質(zhì)的影響

由表2可知，隨著葡萄果實的發(fā)育與成熟，各套袋處理和對照葡萄果實的單果重、縱橫徑和可溶性固形物含量均在逐步增加，而可滴定酸含量則呈逐步下降趨勢。與同期對照相比，套袋處理在多數(shù)時期并未對果實單果重、縱橫徑和果形指數(shù)產(chǎn)生較大影響，但隨著果實的生長發(fā)育，不同類型果袋卻對果實TSS和TA含量產(chǎn)生了不同程度的影響。其中，套袋40 d時，各色果袋處理果實中TSS含量與對照相比均無顯著變化；在套袋50 d時，其TSS含量在白色袋、雙層袋和綠色袋處理下與對照相比仍無顯著變化，而在藍(lán)色和棕色果袋處理下顯著降低；在成熟期(套袋后60 d)時，雙層袋、綠色袋處理TSS含量與對照還無顯著差異，而在白色袋、藍(lán)色和棕色袋處理下均比對照顯著降低，并以藍(lán)色袋降幅最大(19.17%)；而無紡布-白紙雙層果袋和綠色紙袋則未對TSS含量產(chǎn)生較大影響。果實TA含量在白色袋、綠色和棕色袋處理40 d，以及雙層袋處理50 d時均比同期對照顯著降低，其余套袋處理均與同期對照無顯著差異；在果實完全成熟時(套袋后60 d)，藍(lán)色紙袋處理果實中TA含量顯著高于對照，其他果袋處理均未對TA含量產(chǎn)生顯著影響。

表2 不同類型果袋處理下葡萄果實品質(zhì)的變化

2.2 果袋類型對葡萄果實色澤及總花色苷含量的影響

表3顯示，隨著葡萄果實的發(fā)育成熟，套袋處理和對照果實的L*值和b*值整體呈逐漸下降趨勢，而a*值和CIRG值則呈逐步升高趨勢。與對照相比，各取樣時期套袋果實L*值和b*值均高于同期對照，且大多達(dá)到顯著水平；與之相反，各取樣時期套袋果實a*值和CIRG值則均低于同期對照，且CIRG值的變化在各時期均達(dá)到顯著水平?？傮w而言，‘紫金紅霞’葡萄套袋處理有助于果皮亮度L*和黃藍(lán)色差b*值的提高，但卻降低了紅綠色差a*值和果實色澤指數(shù)CIRG。盡管套袋處理不利于CIRG值的增加，但不同類型果袋間處理也存在一定差異，其中對CIRG值影響較小的為無紡布-白紙雙層果袋、綠色紙袋和白色紙袋，而藍(lán)色紙袋和棕色紙袋則對CIRG值影響較大。

表3 不同類型果袋處理下對葡萄果實色澤的變化

為進一步明確不同類型果袋對‘紫金紅霞’葡萄果實著色的影響，本研究對不同處理果皮中的總花色苷含量進行了測定分析。由圖1可知，隨著葡萄果實發(fā)育成熟，套袋處理和對照果皮中總花色苷含量總體均呈逐步增加趨勢。其中，在套袋后40～50 d時，套袋處理果皮中總花色苷含量均顯著低于對照，并以藍(lán)色和棕色果袋處理果皮中花色苷含量最低；在果實完全成熟時(套袋后60 d)，除無紡布-白紙雙層袋處理果皮總花色苷含量與對照樣品之間無顯著差異外，其他套袋處理均比對照顯著降低，顯著抑制了果皮中花色苷的合成。

圖1 不同類型果袋處理下葡萄果皮中總花色苷含量的變化Fig.1 The total anthocyanin content in grape skin under different types of fruit bagging

2.3 果袋類型對葡萄果皮中花色苷合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

qRT-PCR分析結(jié)果(圖2)表明，在葡萄果實發(fā)育后期(套袋后40、50和60 d)，套袋處理對果皮中花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)主要表現(xiàn)為抑制作用。在套袋后40和50 d時，除白色紙袋在套袋后40 d時促進了MYBA1基因的上調(diào)表達(dá)外，其他套袋處理對于相關(guān)基因的表達(dá)主要表現(xiàn)為抑制作用。在套袋后60 d時，不同類型果袋對果皮中花色苷合成相關(guān)基因表達(dá)的影響差異較大，其中，白色紙袋促進了MYBA1、DFR和LDOX基因的上調(diào)表達(dá)，無紡布-白紙雙層果袋則對F3′H和UFGT基因的表達(dá)產(chǎn)生了促進作用，而綠色、藍(lán)色和棕色果袋對于相關(guān)基因的表達(dá)仍表現(xiàn)為抑制作用。

圖2 不同類型果袋處理下轉(zhuǎn)錄因子及花色苷合成相關(guān)基因表達(dá)的變化Fig.2 The expression of transcription factors and anthocyanin synthesis related genes under different types of fruit bagbing

3 討 論

果實套袋是果樹生產(chǎn)中常用的一種栽培管理技術(shù)，由于果實套袋后其生長的微環(huán)境發(fā)生了變化，因此會對果實生長發(fā)育特性和果實品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。果實色澤與果面光潔度是葡萄外觀品質(zhì)的重要指標(biāo)，生產(chǎn)中常通過果實套袋技術(shù)來提高葡萄的外觀品質(zhì)。然而，不同類型的果袋其效果也存在較大的差異，生產(chǎn)中常根據(jù)葡萄品種的具體特點來選擇使用不同類型的果袋[30]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，盡管在‘紫金紅霞’葡萄果實發(fā)育過程中不同套袋處理會對果實品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)產(chǎn)生不同程度的影響，但到果實完全成熟時，除白色、藍(lán)色和棕色果袋抑制了果實中可溶性固形物含量的增高，藍(lán)色果袋阻礙了果實中可滴定酸含量的降低外，套袋處理并未對果實的單果重、縱橫徑、果形指數(shù)等產(chǎn)生顯著影響，這說明套袋不利于‘紫金紅霞’葡萄果實內(nèi)在品質(zhì)的提升，但對果實大小和形狀并不會產(chǎn)生較大的影響[31-32]。

在花色苷含量方面，5種果袋均對‘紫金紅霞’葡萄花色苷的合成產(chǎn)生了一定的影響，其中藍(lán)色和棕色果袋對成熟期果實中總花色苷合成的影響最為顯著，其次是白色和綠色果袋，而無紡布-白紙雙層袋則未對成熟期葡萄果皮中的總花色苷含量產(chǎn)生顯著影響。這與果實色澤分析中，套袋處理果面亮度指標(biāo)L*和黃藍(lán)色差指標(biāo)b*值多顯著高于對照，而紅綠色差a*值和色澤指數(shù)CIRG值多顯著低于對照的研究結(jié)果是一致的。究其原因可能在于光照是影響果實著色的重要因素，充足的光照可通過光合作用為花色苷的合成提供所需的底物，進而促進花色苷的合成[33-34]。但由于藍(lán)色和棕色果袋透光率偏差，白色和綠色果袋透光率稍強，使得不同類型果袋對葡萄果皮中花色苷的合成產(chǎn)生了不同的影響；無紡布-白紙雙層袋未對成熟期果皮中花色苷含量產(chǎn)生顯著影響的原因，可能與果袋透光率和袋內(nèi)溫度雙重環(huán)境因素的變化有關(guān)。

花色苷的合成與積累受多個轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)基因的協(xié)同調(diào)控。已有研究表明，MYBA類轉(zhuǎn)錄因子與果皮中花色苷合成密切相關(guān)[8, 35]，CHS、F3H、DFR、LDOX、UFGT等結(jié)構(gòu)基因也在調(diào)控果實著色方面發(fā)揮著重要的作用[22, 36]。本研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄果實生長發(fā)育后期(套袋后40～60 d)，除白色紙袋外，其他果袋對MYBA1基因的表達(dá)主要表現(xiàn)為抑制作用，這與其他果樹上的研究結(jié)果較為相似[37-38]；對于結(jié)構(gòu)基因而言，除套袋處理60 d時白色紙袋促進了DFR和LDOX基因的上調(diào)表達(dá)、無紡布-白紙雙層袋促進了F3′H、DFR和UFGT的上調(diào)表達(dá)外，其他處理對于果實發(fā)育后期相關(guān)基因的表達(dá)主要表現(xiàn)為抑制作用，這與總花色苷含量的測定結(jié)果基本吻合。尤其對于無紡布-白紙雙層袋而言，成熟期果皮中花色苷含量與對照間并不存在顯著差異，這可能與F3′H、DFR和UFGT三個基因在處理果皮中的上調(diào)表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，套袋處理未對‘紫金紅霞’葡萄果實單果重和果型指數(shù)產(chǎn)生顯著影響，但不利于果實可溶性固形物含量和果實色澤指數(shù)的提高；不同類型果袋可通過抑制花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)，進而阻礙果皮中花色苷的合成。套袋處理雖對果實內(nèi)在品質(zhì)和著色產(chǎn)生了一定的不利影響，但卻有利于果面光潔度和整體外觀品質(zhì)的提高。綜合分析認(rèn)為由于無紡布-白紙雙層袋對成熟期果實綜合品質(zhì)影響最小，因此可作為‘紫金紅霞’葡萄套袋的優(yōu)先選擇；其次是白色和綠色紙袋；而由于藍(lán)色和棕色果袋對果實綜合品質(zhì)產(chǎn)生了較大的不利影響，因此不適用于該品種果實套袋。