趙敏智，林志艷，張 加,許衛(wèi)兵,蒲陸梅*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070;2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

目前臨床診斷中使用最多的成像技術(shù)分別是X射線計(jì)算機(jī)斷層成像(CT成像)、正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層成像(PET成像)、熒光成像(FI成像)和磁共振成像(MRI成像)[1-4]，其中MRI利用人體不同組織間弛豫時(shí)間的差異進(jìn)行成像，具有空間分辨率高、不受組織穿透能力的限制和對(duì)人體無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越受到關(guān)注[5].然而，為了增加不同組織圖像的對(duì)比度，提高診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，在測(cè)試MRI之前需注射造影劑.MRI造影劑可分為T(mén)1和T2型兩種，T1型造影劑通過(guò)降低組織周?chē)肿又匈|(zhì)子的縱向弛豫時(shí)間，從而增強(qiáng)磁共振成像信號(hào)，因其對(duì)MRI圖像有增加亮度的作用，又被稱(chēng)為陽(yáng)性造影劑.T2型造影劑通過(guò)降低組織周?chē)肿又匈|(zhì)子的橫向弛豫時(shí)間，從而減弱磁共振成像信號(hào)，因其對(duì)MRI圖像有增加暗度的作用，又被稱(chēng)為陰性造影劑,所以臨床中基本不使用[6].臨床中獲準(zhǔn)應(yīng)用的主要是使信號(hào)增強(qiáng)的T1造影劑，其中釓(Gd)離子由于核外具有7個(gè)未成對(duì)電子，表現(xiàn)出最強(qiáng)的順磁性，能夠最大程度的增強(qiáng)MRI信號(hào)強(qiáng)度而被廣泛用作T1型造影劑[7].

Huang等[8]以Gd(NO3)3·6H2O和Eu(NO3)3·6H2O為起始原料，采用一鍋水熱法合成了Gd(OH)3∶Eu-NRs， 其縱向弛豫率r1為4.78 L·mmol-1·s-1.Park等[9]利用Gd(NO3)3·6H2O和不同溶劑合成了具有棒狀、顆粒狀和片狀的Gd(OH)3納米晶體，然而其縱向弛豫率r1為2.58～7.17 L·mmol-1·s-1.Huang等[10]合成了一種具有FI的高靈敏度和MRI的高空間分辨率優(yōu)點(diǎn)的雙模式成像材料Gd-CQDs@N-Fe3O4，r1為5.16 L·mmol-1·s-1，r2為115.6 L·mmol-1·s-1，r2/r1=22.4.Ren等[11]制備了顯示綠色熒光的釓螯合功能化碳量子點(diǎn)[Gd(Ⅲ)/CQDs],具有很好的磁共振性能，r1為6.4 L·mmol-1·s-1.雖然已有大量基于Gd(Ⅲ)的T1型造影劑被成功制備，然而，目前釓基造影劑仍然面臨縱向弛豫率低的問(wèn)題.因此設(shè)計(jì)制備弛豫性能較高的Gd基造影劑具有重要意義.

近年來(lái)中空結(jié)構(gòu)的材料由于具有較大的內(nèi)部空間、較高的比表面積以及小的密度等優(yōu)點(diǎn)，因而在化學(xué)工程、制藥和生物應(yīng)用等各個(gè)領(lǐng)域都有很大的應(yīng)用前景.基于以上分析，文中首先以葡萄糖為原料，用水熱法制備碳微球模板，再以尿素作為沉淀劑制備了前驅(qū)體，最后利用高溫煅燒除去碳微球模板，成功制備了具有中空結(jié)構(gòu)的Gd2O3微球.對(duì)中空Gd2O3微球的形貌、結(jié)構(gòu)、表面修飾基團(tuán)、細(xì)胞毒性和造影劑性能進(jìn)行了詳細(xì)的表征.研究了所制備中空微球造影劑的體外毒性和馳豫性能，并將其應(yīng)用于活體小鼠模型的造影.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

六水硝酸釓(Gd(NO3)3·6H2O，99%)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖(C6H12O6)和甲醛(CH2O)溶液購(gòu)于煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；尿素購(gòu)于天津市津東天正精細(xì)化工試劑廠；無(wú)水乙醇購(gòu)于成都市科隆化學(xué)品有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、胎牛血清(FBS)均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司；昆明小鼠購(gòu)于蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院；去離子水實(shí)驗(yàn)室自制.

1.2 碳微球的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取2.00 g葡萄糖和量取2.00 mL甲醛溶液溶解于25.00 mL去離子水中，待形成澄清透明溶液后，將其轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯內(nèi)襯中并密封于不銹鋼反應(yīng)釜中，于160 ℃烘箱中加熱6 h.待反應(yīng)釜自然冷卻至室溫后，將反應(yīng)釜中的溶液倒出并離心，棄去上清液，得黑褐色沉淀物，用乙醇和去離子水洗滌3次，置于80 ℃烘箱中烘干6 h，得到碳微球.

1.3 中空Gd2O3微球的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.902 g Gd(NO3)3溶于60.00 mL去離子水中，劇烈攪拌下加入6.00 g尿素，待形成澄清透明的溶液后，加入0.200 g上述制備的碳微球，并超聲15 min.隨后將溶液轉(zhuǎn)入圓底燒瓶中,劇烈攪拌下于85 ℃持續(xù)反應(yīng)6.0 h，待溶液冷卻至室溫后離心收集沉淀物，稱(chēng)為前驅(qū)體.將干燥后的前驅(qū)體置于馬弗爐中于800 ℃下煅燒2.0 h獲得中空Gd2O3微球.

1.4 測(cè)試與表征

利用iS50 FT-IR(Nicolet公司)對(duì)樣品進(jìn)行傅里葉紅外光譜表征.用Netzsch STA 409 PC Analyzer熱重分析儀以10 ℃·min-1的升溫速度，從25 ℃到900 ℃對(duì)樣品進(jìn)行熱重分析.中空Gd2O3微球的粒度和Zeta電位由Zeta粒度分析儀(SALD，2300，SHIMADZU)在室溫下測(cè)得.使用VG MultiLab 2000對(duì)樣品進(jìn)行XPS分析.中空Gd2O3微球的XRD數(shù)據(jù)由XRD-6100(日本島津)測(cè)量.TEM形貌由JEM-2100(日本株式會(huì)社)在200 kV下采集.利用JSM-6701F(日本株式會(huì)社)掃描電子顯微鏡觀察樣品的形貌，表征前需要對(duì)樣品進(jìn)行離子濺射噴金2 min.采用電感耦合等離子體(ICPPLASMA 1000)法測(cè)定溶液中Gd3+的準(zhǔn)確濃度.樣品的T1和T2加權(quán)圖像是在0.5 T核磁共振分析儀(MesoMR23-060H-Ⅰ, 蘇州Niumag分析儀器有限公司)上采集.

1.5 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

使用MTT法評(píng)估中空微球的細(xì)胞毒性.人肝癌細(xì)胞HepG2用包含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100 U·mL-1)和鏈霉素(0.1mg·mL-1)的RPMI 1640培養(yǎng)基在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將HepG2(5×103/孔)細(xì)胞接入96孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，然后加入不同Gd(Ⅲ)濃度的(20,40,80,160,320 μg L-1)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg·mL-1)在培養(yǎng)箱中孵化4 h，棄去每孔中的培養(yǎng)基并加入150 μL DMSO，振蕩10 min，在490 nm的酶標(biāo)儀下記錄其吸光度(OD)，用下式計(jì)算細(xì)胞存活率.

1.6 體外活性測(cè)試

準(zhǔn)確稱(chēng)取200 mg中空Gd2O3微球分散在10 mL環(huán)己烷中，加入100 μL吐溫-20，超聲1 h后獲得白色乳狀液，在白色乳狀液中加入10 mL蒸餾水并置于75℃水浴鍋中加熱攪拌2 h，便得中空Gd2O3微球溶液[12].

1.7 活體試驗(yàn)

取8周齡的昆明小鼠6只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組3只，分別注射60 μL 8%水合氯醛誘導(dǎo)麻醉，對(duì)小鼠進(jìn)行注射前掃描成像，隨后將100 μL中空Gd2O3微球溶液通過(guò)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，分別于注射后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠進(jìn)行成像.掃描成像均采用T1加權(quán)成像TR=500 ms，TE=20 ms，切片厚度為1.7 mm，25 ℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 制備與表征

如圖1所示，中空Gd2O3微球的形成過(guò)程分為3步:① 以葡萄糖為原料，在高溫高壓條件下將其脫水碳化形成碳微球模板；② 以尿素為沉淀劑，將Gd3+在溶液中轉(zhuǎn)化為Gd(OH)CO3，而后沉積在碳微球模板的表面，形成具有核殼結(jié)構(gòu)的前驅(qū)體；③ 空氣氣氛中經(jīng)過(guò)800℃煅燒，前驅(qū)體中的碳微球核模板被碳化燃燒去除，無(wú)定形的Gd(OH)CO3外殼受熱被分解生成Gd2O3，進(jìn)而獲得中空Gd2O3微球.

圖1 中空Gd2O3微球的形成示意圖

首先對(duì)碳微球、前驅(qū)體、中空Gd2O3微球進(jìn)行紅外光譜分析.如圖2所示，從碳微球的曲線可以看出，在3 412 cm-1處的吸收峰歸屬于羥基(—OH)的伸縮振動(dòng)，1 706 cm-1處對(duì)應(yīng)羰基(C=O)的振動(dòng)，以上2種極性基團(tuán)有利于提高碳微球在水中的分散性.1 612 cm-1處的吸收峰為雙鍵(C=C)的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，表明在碳微球形成過(guò)程中發(fā)生了碳化反應(yīng)[13-14].1 202和1 021 cm-1處分別對(duì)應(yīng)C—OH和糖苷鍵(—C—O—C—)的伸縮振動(dòng)，證明反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生了葡萄糖縮聚.前驅(qū)體的紅外圖譜中歸屬于C=O的振動(dòng)峰略有減弱，這可能是由于碳微球模板被Gd(OH)CO3包裹所導(dǎo)致.而位于1 550和1 450 cm-1處的吸收峰相較于碳微球模板有所增強(qiáng)，這是由于前驅(qū)體上殘留的沉淀劑尿素引起.中空Gd2O3微球中幾乎無(wú)碳微球和前驅(qū)體中的官能團(tuán)，這是由于經(jīng)過(guò)高溫煅燒后，碳微球模板已經(jīng)完全被除去,而Gd(OH)CO3也全部轉(zhuǎn)化為Gd2O3所引起.在534 cm-1處出現(xiàn)了新的峰，可以將其歸屬于Gd—O鍵的伸縮振動(dòng)[15-16].基于以上分析,說(shuō)明經(jīng)過(guò)煅燒后前驅(qū)體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化為中空Gd2O3微球.

圖2 碳球、前驅(qū)體和中空Gd2O3微球的FT-IR光譜

圖3 碳球、前驅(qū)體和中空Gd2O3微球的熱重曲線

圖3為碳微球、前驅(qū)體和中空Gd2O3微球的熱重分析曲線.可以看出當(dāng)溫度升高到500℃時(shí)，碳微球的質(zhì)量損失接近100%，說(shuō)明碳微球模板在800 ℃煅燒后可以完全去除.對(duì)于前驅(qū)體，25～150 ℃失重約為5.8%，這是由于吸附在材料表面的水分揮發(fā)所導(dǎo)致；200～500 ℃的質(zhì)量損失則歸屬于前驅(qū)體中碳微球的燃燒所造成，質(zhì)量損失為32.6%；500～700 ℃的緩慢失重可歸因于前驅(qū)體中Gd(OH)CO3轉(zhuǎn)化為Gd2O3，失重約為8.3%.觀察中空Gd2O3微球的曲線可以看到，中空Gd2O3微球幾乎沒(méi)有失重，說(shuō)明煅燒后形成了純的中空Gd2O3微球.

圖4為碳微球、前驅(qū)體及中空Gd2O3微球的粒徑分布圖.可以看出所制備的碳微球、前驅(qū)體和中空Gd2O3的平均粒徑分別約為450,600和550 nm，分布系數(shù)分別為0.456,0.154和0.434，表明該中空微球形成了單分散分布.前驅(qū)體粒徑增大可能是因?yàn)镚d(OH)CO3附著在碳微球表面，而中空Gd2O3微球粒徑略微減小可能是由于煅燒過(guò)程中碳微球模板被完全除去，Gd(OH)CO3在轉(zhuǎn)變?yōu)镚d2O3的過(guò)程中有所收縮導(dǎo)致.碳模板、前驅(qū)體和中空Gd2O3的電位如圖5所示，3種材料的電位值分別為-23.73,-24.75和-16.82 mV，較大的負(fù)電位有利于材料發(fā)揮生物活性.

圖4 碳球、前驅(qū)體和中空Gd2O3微球的粒徑

圖5 碳球、前驅(qū)體和中空Gd2O3微球的電位

圖6為碳微球模板、前驅(qū)體和中空Gd2O3微球的XRD圖譜.碳微球在2θ為22.0°出現(xiàn)寬峰，對(duì)應(yīng)于石墨的(002)晶面，表明經(jīng)過(guò)水熱反應(yīng)后，葡萄糖已被完全碳化.而前驅(qū)體分別在2θ=16.36°,20.94°,24.57°,27.33°和34.36°處有明顯的衍射峰，很好地與Gd(OH)CO3標(biāo)準(zhǔn)卡片(JCPDS No.43-0604)對(duì)應(yīng)，可以推測(cè)無(wú)定形產(chǎn)物為Gd(OH)CO3.經(jīng)過(guò)800 ℃煅燒后產(chǎn)物中空Gd2O3微球在2θ=20.0°,28.5°,47.5°和56.3°有強(qiáng)衍射峰，分別對(duì)應(yīng)(211),(222),(400)和(622)晶面衍射峰，這與Gd2O3標(biāo)準(zhǔn)卡(JCPDS No.43-1014)對(duì)應(yīng)，并且沒(méi)有形成其他的雜峰，說(shuō)明制備的中空Gd2O3微球是純立方相的Gd2O3.

圖6 碳球、前驅(qū)體和Gd2O3中空微球的XRD圖譜

用XPS對(duì)中空Gd2O3微球的表面化學(xué)組成進(jìn)行了測(cè)定.XPS全譜如圖7a所示,結(jié)合能為141,1 187和531 eV的峰分別對(duì)應(yīng)于Gd 4d,Gd 3d和O 1s，可以看出樣品中只存在O和Gd兩種元素，進(jìn)一步證明經(jīng)過(guò)高溫煅燒后，前驅(qū)體已經(jīng)發(fā)生完全轉(zhuǎn)變[17-18].圖7b為O元素的精細(xì)圖譜，其中Gd2O3中的O結(jié)合能位于530 eV，而位于527 eV處的O元素則來(lái)源于結(jié)合在材料表面的水分子[19].Gd元素的精細(xì)譜如圖7c所示，其中Gd 3d5/2和Gd 3d3/2的結(jié)合能分別為1 187和1 218 eV.定量分析表明, 中空Gd2O3微球表面O和Gd兩種元素的原子百分比含量分別為39.90%和2.76%.值得注意的是其中發(fā)現(xiàn)了原子百分比為31.19%的碳元素，這可能來(lái)源于殘留的碳和空氣中的CO2.

圖7 中空Gd2O3微球的XPS譜

通過(guò)掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)分析了中空Gd2O3微球的形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu).SEM形貌如圖8(a)所示，可以看出所制備的中空Gd2O3微球表面光滑，部分粒子呈現(xiàn)出較為規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，還有部分結(jié)構(gòu)為橢球形，大量的粒子由于高的表面結(jié)合能而出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，這可能與樣品的高溫煅燒有關(guān)，其尺寸約為500 nm.圖8(b)為T(mén)EM形貌，可以看出淺色邊緣與深色中心形成鮮明對(duì)比，顯示出良好的中空結(jié)構(gòu)，殼厚約為20 nm，且粒徑分布較為均一，有良好的球形結(jié)構(gòu).

(a)掃描電鏡 (b)透射電鏡

2.2 MTT及體外MRI

較低的毒性是生物醫(yī)用材料的首要要求.不同濃度的中空Gd2O3微球?qū)ePG2細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)圖9.可以看出，在低濃度時(shí)HepG2細(xì)胞的活性基本與對(duì)照組相同，達(dá)到了93.7%，即使在濃度為320 μg·L-1時(shí)，細(xì)胞存活率仍然高于90%，表明所制備的中空微球?qū)epG2細(xì)胞無(wú)明顯的毒副作用，表現(xiàn)出較好的生物相溶性.

圖9 HepG2細(xì)胞與不同濃度的中空Gd2O3微球(0，20，40，80,160,320 μg·L-1)孵化48 h后的存活率

為進(jìn)一步研究所制備中空微球的體外MRI性能，配置了一系列包含Gd3+濃度不同的中空Gd2O3微球溶液，Gd3+的濃度利用ICP-MS結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)試.以5%的硝酸溶液作為溶劑，首先配置了濃度為25,50,100,250和500 μg·L-1的Gd3+標(biāo)準(zhǔn)溶液，于ICP-MS上測(cè)試上述標(biāo)準(zhǔn)溶液的信號(hào)強(qiáng)度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖10)，可以看出,所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值為0.996 8，表現(xiàn)出較好的線性相關(guān)性.將所配置5個(gè)不同濃度的Gd2O3溶液同樣進(jìn)行ICP-MS測(cè)試，將其溶液的信號(hào)強(qiáng)度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確獲得所配置溶液中釓離子的濃度如圖10所示，濃度在0.015 6～0.254 9 mmol·L-1，顯示出較好的梯度性.

圖10 ICP-MS測(cè)得Gd3+標(biāo)準(zhǔn)曲線及用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得樣品中Gd3+的濃度

在獲得準(zhǔn)確濃度的基礎(chǔ)上，研究了所制備的中空Gd2O3微球溶液的體外核磁共振造影性能.圖11為5個(gè)不同Gd離子濃度的中空Gd2O3微球溶液的T1,T2加權(quán)圖像，以純水作為對(duì)照，可以看出隨著釓離子濃度的增大，T1,T2加權(quán)圖像都逐漸變亮，但是T1圖像的增加程度要高于T2的，進(jìn)一步說(shuō)明該中空微球可作為較好的T1造影劑.

圖11 T1,T2體外加權(quán)圖像(從左至右Gd3+濃度依次為0,0.015 6,0.031 3,0.062 5,0.125 0, 0.250 0 mmol·L-1)

隨后分別測(cè)試了所配置溶液的縱向(T1)和橫向(T2)弛豫時(shí)間，分別以1/T1和1/T2對(duì)Gd3+濃度作圖，進(jìn)行線性擬合，則擬合曲線斜率即對(duì)應(yīng)為縱向(r1)和橫向(r2)弛豫率，結(jié)果如圖12所示，所制備中空Gd2O3微球的縱向(r1)和橫向(r2)弛豫率分別為10.46和13.82 L·mmol-1·s-1，其中r1值是目前臨床用造影劑(4.0 L·mmol-1·s-1)的2.5倍，同時(shí)r2/r1的比值低至1.32[20]，表明該中空Gd2O3微球可作為T(mén)1型造影劑.

圖和與不同濃度Gd3+之間的線性相關(guān)曲線

圖13 尾靜脈注射Gd2O3空心微球溶液后不同時(shí)間的掃描成像

2.3 活體MRI測(cè)試

通過(guò)活體成像進(jìn)一步驗(yàn)證了中空Gd2O3微球的MRI性能，由于Gd2O3在純水中的分散性有限，因此加入無(wú)毒且生物相容性好的吐溫-20作為分散劑，將Gd2O3微球配制成濃度為10 mg·mL-1的Gd3+溶液，取20 μL對(duì)小鼠進(jìn)行尾靜脈注射，注射前和注射后不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠冠位T1加權(quán)成像見(jiàn)圖13.可以看出，相較于注射前的小鼠全身圖像，注射中空Gd2O3微球后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠整個(gè)身體圖像的亮度都有所提高，說(shuō)明該微球經(jīng)靜脈注射后很快進(jìn)入小鼠體液循環(huán)，而肝臟部位的變化最為明顯；注射8 h后，亮度達(dá)到最高值，此后圖像的亮度隨著時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)而逐漸降低；24 h后，基本恢復(fù)到注射前的水平，表明該中空微球被順利的排出小鼠體外.上述結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明所制備的中空Gd2O3微球能夠提高小鼠模型的T1圖像亮度，這對(duì)于提高診斷的準(zhǔn)確性有著重要的意義，也進(jìn)一步表明所制備的中空Gd2O3微球作為T(mén)1型造影材料展示出良好的應(yīng)用前景.

3 結(jié)論

通過(guò)碳微球模板法，成功制備了中空Gd2O3微球，該微球直徑約為500 nm，殼厚約為20 nm，電位為-16.82 mV.體外活性表明該微球具有較低的細(xì)胞毒性，縱向弛豫率r1為10.457 L·mmol-1·s-1，且r2/r1=1.32，被用于小鼠活體成像表現(xiàn)出較好的造影效果，有望作為新型的T1型造影劑被廣泛應(yīng)用于成像技術(shù).