盛云，許靜*

（1.江蘇省盱眙縣盱城街道綜合服務中心江蘇淮安 211700；2.江蘇省盱眙縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所江蘇淮安 211700）

二甲亞砜是一種極性溶劑，跟水分子有很強的結(jié)合力并且易溶于水，可以快速通過細胞膜，使細胞快速脫水，降低冷凍液凝固點，從而減少細胞內(nèi)形成的冰晶[1,2]?？箖霰Ｗo劑是為了防止低溫對細胞造成損傷如精子DNA 損傷而添加的一種物質(zhì)，抗凍保護劑主要分為滲透性和非滲透性抗凍保護劑，如甘油、丙二醇和本試驗中的DMSO 等滲透性抗凍保護劑，如卵黃、牛血清白蛋白和果糖等非滲透性抗凍保護劑[3-5]。甘油又稱丙三醇，是最早在綿羊精液中使用的通透性很強的抗凍保護劑，其可以降低胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度，同時可以進入精子內(nèi)部，減緩脫水速度，防止精子的滲透性損傷和細胞蛋白質(zhì)的變性，但過高濃度的甘油有一定的毒性作用，會導致精子結(jié)構(gòu)的損傷和酶活性的降低[6,7]。卵黃是大分子非滲透性抗凍保護劑，其中含有的卵磷脂和低密度脂蛋白可以附著在精子表面，降低精子的冷休克，另外卵黃還可以調(diào)節(jié)滲透壓和離子濃度，同時為精子的運動和代謝提供能量，因此卵黃可以提高精液的保存品質(zhì)，但卵黃屬于動物源性的抗凍保護劑，存在一定的不穩(wěn)定性和疾病傳播感染的風險[8-10]。因此為了避免動物源性抗凍保護劑和有毒害作用的甘油對精液的影響，本試驗在稀釋液中添加不同濃度的DMSO，通過采用CASA 檢測精液低溫保存期間的精子活率、活力、直線速率、曲線速率和路徑速率等，探究了DMSO 在綿羊精液低溫保存中的作用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）試驗動物本試驗所用精液采自于江蘇綠森然有限公司提供的3 只健康湖羊，年齡為2 歲，湖羊膘情適宜，無任何疾病，體質(zhì)健壯。

2）主要試劑與藥品DMSO、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、果糖、檸檬酸、青霉素鈉和硫酸鏈霉素。

1.2 試驗設計

本試驗采用含有0、0.5%、1%、2%和3%DMSO 的綿羊精液低溫保存稀釋液對綿羊精液進行4℃低溫保存，每隔24h 輕輕翻動精液，防止精子沉淀聚積而產(chǎn)生損傷。在精液保存期間，每天采用CASA 對精子活率、活力、直線速率、曲線速率、路徑速率、鞭打頻率和擺動性進行檢測，以評價不同濃度的DMSO 對綿羊精液低溫保存的作用效果。

1.3 試驗方法

1）稀釋液配置使用電子天平準確稱取15.35g 的Tris、8.2g 的檸檬酸、10.00g 的果糖、0.15g 的青霉素鈉和0.35g 的硫酸鏈霉素，充分溶解于500.00mL 滅菌的超純水，配置成基礎稀釋液。分別取100.00、99.50、99.00、98.00 和97.00mL 的基礎稀釋液，分別加入0、0.5、1、2 和3mL 的DMSO，配置成DMSO 濃度為0（對照組）、0.5%、1%、2%和3%的稀釋液。

2）精液采集與稀釋采用假陰道法采集公羊精液，采精結(jié)束后，將精液置于37℃保溫杯，并在30min 內(nèi)帶回實驗室。對精液品質(zhì)進行常規(guī)檢查，選取顏色、氣味和射精量正常的精液鏡檢，選取精子活力80%以上、畸形率低于15%的精液進行混勻處理，采用預熱的含有不同濃度DMSO 的稀釋液進行稀釋，然后用多層棉花包裹置于4℃冰箱。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 對試驗數(shù)據(jù)進行整理，利用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，處理結(jié)果用“平均值±標準誤”表示。每組設置有3 個重復，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 試驗結(jié)果

2.1 在低溫保存下不同濃度DMSO 對綿羊精子活率的影響

由表1 可知，添加不同濃度DMSO 的稀釋液在對綿羊精液低溫保存期間，在各時間段均能顯著提高精子活率（P＜0.05）。各處理組的精子活率隨著DMSO 濃度的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且2%添加量的精子活率最高。保存1、5 和8d 時，2%處理組的精子活率顯著高于其它各組（P＜0.05）；保存2～4 和7d 時，2%、3%處理組的精子活率顯著高于其它各組（P＜0.05），但2%和3%處理組的精子活率差異不顯著；在保存6d 時，2%處理組的精子活率顯著高于對照組、0.5%和1%處理組的精子活率（P＜0.05），但與3%處理組的精子活率差異不顯著。

表1 在低溫保存下不同濃度DMSO對綿羊精子活率的影響（單位：%）

2.2 在低溫保存下不同濃度DMSO 對綿羊精子活力的影響

由表2 可知，添加不同濃度DMSO 的稀釋液在對綿羊精液低溫保存期間，在各時間段均能提高精子活力。各處理組的精子活力隨著DMSO 濃度的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且2%添加量的精子活力最高。在保存1 和6d 時，1%、2%和3%處理組的精子活力顯著高于對照組和0.5%處理組的精子活力（P＜0.05）；保存2 和5d 時，2%處理組顯著高于對照組、0.5%和1%處理組的精子活力（P＜0.05），但與3%處理組的精子活力差異不顯著；保存3～4d 時，2%和3%處理組的精子活力顯著高于其它各組（P＜0.05），但2%和3%處理組的精子活力差異不顯著；保存7～8d 時，2%處理組的精子活力顯著高于其它各組（P＜0.05）。

表2 在低溫保存下不同濃度DMSO對綿羊精子活力的影響（單位：%）

2.3 在低溫保存下不同濃度DMSO 對綿羊精子運動性能的影響

結(jié)果見表3，保存2d 時，1%和3%處理組的直線速率顯著高于對照組和2%處理組的直線速率（P＜0.05），但與0.5%處理組的直線速率差異不顯著；保存4d 時，0.5%處理組的直線速率顯著高于對照組和1%處理組的直線速率（P＜0.05），但與2%和3%處理組的直線速率差異不顯著；保存5d 時，1%處理組的直線速率顯著高于對照組、0.5%和2%處理組的直線速率（P＜0.05），但與3%處理組的直線速率差異不顯著；保存6d 時，1%處理組的直線速率顯著高于對照組和0.5%處理組的直線速率（P＜0.05），但與2%和3%處理組的直線速率差異不顯著；保存7d 時，3%處理組的直線速率顯著高于1%處理組的直線速率（P＜0.05），但與其它各組差異不顯著。

表3 在低溫保存下不同濃度DMSO對綿羊精子運動性能的影響

保存1d 時，2%處理組的精子直線速率、曲線速率、路徑速率最高，但與其它各組差異不顯著；保存2d 時，各處理組的曲線速率、路徑速率均顯著高于對照組（P＜0.05），但各處理組間差異不顯著；保存3 和6d 時，2%處理組的曲線速率、路徑速率最高，且顯著高于對照組（P＜0.05），但與其它各組間差異不顯著；保存4d 時，2%處理組的曲線速率顯著高于對照組和0.5%處理組（P＜0.05），但與其它各組差異不顯著；保存5d 時，1%和2%處理組的曲線速率、路徑速率顯著高于其它各組（P＜0.05），但1%和2%處理組間的差異不顯著；保存7d 時，3%處理組的曲線速率、路徑速率顯著高于0.5%和1%處理組（P＜0.05），但與其它各組差異不顯著。

保存4d 時，2%處理組的精子鞭打頻率最高，但與其它各組差異不顯著；保存5d 時，2%處理組的精子鞭打頻率顯著高于對照組（P＜0.05）；保存2、5～6 和8d 時，2%處理組的精子擺動性顯著高于對照組（P＜0.05）。