胡彪群，王筱蘭*，鐘益清，肖永梅

(1.江西師范大學生命科學學院，江西南昌330022;2.江西國藥有限責任公司，江西南昌330052)

0 引言

林可霉素又稱潔霉素，是林肯鏈霉菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有抗革蘭氏陽性菌的能力，主要作用于敏感菌核糖體的50S亞基，達到阻止肽鏈延長的目的，從而抑制細菌細胞蛋白質合成［1－3］.林可霉素與其他抗生素沒有交叉耐藥性，本身毒性較低，因此，林可霉素及其衍生物被廣泛用于醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)，是國內外制藥企業(yè)重點生產(chǎn)的抗生素［4－6］.

目前，林可霉素發(fā)酵多采用液化糖，液化糖主要由企業(yè)自己生產(chǎn)，通過α－淀粉酶和糖化酶水解淀粉所得［7］，主要成分為還原糖.液化液是液化糖生產(chǎn)的中間產(chǎn)物，主要成分為糊精和低聚糖.淀粉要徹底糖化需多種水解酶、更多酶量、更長降解時間，因此，成本提高了.本文比較研究2種不同淀粉水解產(chǎn)物對林可霉素生產(chǎn)的影響，以期實現(xiàn)林可霉素生產(chǎn)成本降低和生產(chǎn)周期縮短的目標.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

FUS－50L(A)自控發(fā)酵罐(上海國強生化工程裝備有限公司);Eclipse E200光學顯微鏡(日本Nikon公司);WZZ－2S數(shù)字式自動旋光儀(上海精密科學儀器有限公司).

豆餅粉、液化液、液化糖等發(fā)酵原材料均由江西國藥有限責任公司提供;其他化學試劑均為分析純.

1.2 菌種

Streptomyces lincolnensis 13由江西國藥有限責任公司提供.

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(質量體積比):黃豆餅粉0.60%，可溶性淀粉1.50%，瓊脂1.80%，MgSO4·7H2O 0.05%，NaCl 0.05%，KH2PO40.05%，KNO30.01%，pH值為7.0～7.5.

種子培養(yǎng)基(質量體積比):黃豆餅粉1.80%，可溶性淀粉1.50%，葡萄糖1.60%，玉米漿2.00%(體積比)，CaCO30.50%，(NH4)2SO40.30%，pH 值為7.0～7.5.

搖瓶培養(yǎng)基(質量體積比):黃豆餅粉1.80%，可溶性淀粉1.50%，葡萄糖6.00%，玉米漿1.50%(體積比)，NaNO30.70%，(NH4)2SO40.80%，NaCl 0.50%，KH2PO40.05%，CaCO30.50%，pH 值為7.0～7.5.

15 L發(fā)酵罐基礎培養(yǎng)基(質量體積比):黃豆餅粉2.00%，可溶性淀粉1.50%，葡萄糖3.50%，玉米漿1.50%，NaCl 0.40%，(NH4)2SO40.80%，KH2PO40.10%，CaCO30.50%，泡敵 0.03%～0.04%(體積比)，豆油0.02%～0.03%(體積比)，pH值為7.0～7.5.

50 L實驗發(fā)酵罐基礎培養(yǎng)基(質量體積比):黃豆餅粉2.00%，液化液6.00%，玉米漿1.50%(體積比)，NaCl 0.50%，(NH4)2SO40.20%，KH2PO40.02%，CaCO30.80%，泡敵0.03%～0.04%(體積比)，豆油0.02%～0.03%(體積比)，pH值為7.0～7.5.

50 L對照發(fā)酵罐基礎培養(yǎng)基(質量體積比):黃豆餅粉2.00%，液化糖6.00%，玉米漿1.50%(體積比)，NaCl 0.50%，(NH4)2SO40.20%，KH2PO40.02%，CaCO30.80%，泡敵0.03%～0.04%(體積比)，豆油0.02%～0.03%(體積比)，pH值為7.0～7.5.

1.4 培養(yǎng)方法

斜面孢子培養(yǎng):將菌種從沙土管中接到斜面培養(yǎng)基于30℃恒溫培養(yǎng)7 d.

發(fā)酵種子培養(yǎng):將斜面孢子懸浮液接種到裝有30mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，于220 r·min－1、30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d.

搖瓶發(fā)酵:將10%接種量接種于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL 搖瓶中，于220 r·min－1、30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d.

15 L發(fā)酵罐上發(fā)酵:將10%搖瓶接種量接種于15 L發(fā)酵罐中，進行二級擴大培養(yǎng)，30℃恒溫培養(yǎng)2 d，罐壓為0.03～0.05 MPa，轉速為350 r·min－1.

50 L發(fā)酵罐上發(fā)酵:將15 L罐的種子按15%的接種量接種至50 L發(fā)酵罐中，30℃恒溫發(fā)酵8 d，罐壓為 0.03～0.05 MPa，轉速為 350 r·min－1.

1.5 分析方法

用旋光法測定生物效價［8－9］、斐林試劑法測定總糖與還原糖［10］、甲醛氧化法測定氨基氮［11］.采用美蘭染色法檢查菌絲形態(tài).取l0mL發(fā)酵液于3000 r·min－1、離心 10min，倒出上清液，計算濕菌體濃度［12］.

2 結果與分析

2.1 在基礎培養(yǎng)基中以液化液代替液化糖發(fā)酵

在基礎培養(yǎng)基中進行林可霉素的發(fā)酵，實驗罐用液化液，對照罐用液化糖，其他成分、培養(yǎng)條件、接種量及菌種批次都相同.接種8 h后每隔8 h取樣，進行總糖、還原糖、氨基氮、濕菌體濃度的測定及菌絲形態(tài)檢查.根據(jù)檢測到的還原糖和氨基氮含量進行碳源和氮源的補充，還原糖濃度控制在3.2～8.0 g·L－1，氨基氮濃度控制在0.462～0.700 g·L－1.

如圖1(數(shù)據(jù)為3批實驗平均值)所示，在基礎料中液化液的濕菌體濃度在前期比液化糖的低，但在中后期始終比液化糖的高.如圖2所示，24 h時實驗罐的菌絲少，對照罐的菌絲多，但96 h時實驗罐的菌絲比對照罐的菌絲多且菌絲舒展，168 h時實驗罐及對照罐的菌絲都開始自溶，林可霉素生產(chǎn)能力下降.由此可知，基礎料中液化液在前期菌絲生長不如液化糖的快，但在中后期卻比液化糖的快.

圖1 實驗罐和對照罐發(fā)酵過程中濕菌體濃度變化

接種40 h后每隔24 h進行效價測定，發(fā)酵效價變化情況如圖3所示(3批實驗數(shù)據(jù))，發(fā)酵前期實驗罐的發(fā)酵效價低于對照罐，但發(fā)酵中后期實驗罐的效價高于對照罐.實驗罐的最終放罐效價分別為6517、6398 和6300 μg·mL－1，平均值為 6405 μg·mL－1，對照罐的最終放罐效價分別為6018、5896和5777 μg·mL－1，平均值為5897 μg·mL－1，實驗罐的平均發(fā)酵效價比對照罐的提高了8.6%.

2.2 基礎培養(yǎng)基及補糖中均用液化液代替液化糖發(fā)酵

實驗方法如本文2.1節(jié)所述，只是在進行碳源補充時，實驗罐用液化液，對照罐用液化糖.濕菌體濃度變化如圖4(數(shù)據(jù)為3批實驗平均值)所示，結果和2.1節(jié)類似，此時實驗罐中后期的濕菌體濃度略高于2.1節(jié)中的實驗罐.如圖5所示，48、96和144 h時實驗罐的菌絲均比對照罐的菌絲長得更好，菌絲更多、更舒展.

接種40 h后每隔24 h進行效價測定，發(fā)酵效價變化情況如圖6(3批實驗)所示，前期實驗罐的發(fā)酵效價低于對照罐，但中后期實驗罐高于對照罐.實驗罐最終放罐效價分別為6789、6614和6511 μg·mL－1，平均值為 6638 μg·mL－1，對照罐最終放罐效價分別為6054、5875 和5789 μg·mL－1，平均值為5906 μg·mL－1，實驗罐平均發(fā)酵效價比對照罐的提高了12.4%.

圖2 實驗罐和對照罐菌絲形態(tài)

圖3 實驗罐和對照罐3個批次的發(fā)酵效價

圖4 實驗罐和對照罐發(fā)酵過程中濕菌體濃度變化

3 討論

在基礎培養(yǎng)基或基礎培養(yǎng)基和補糖中都用液化液代替液化糖生產(chǎn)林可霉素，通過濕菌體濃度檢測及菌絲形態(tài)顯微觀察，結果表明，40 h之前菌體長勢均沒有使用液化糖的好，這是因為液化液還原糖很少，即遠低于液化糖中的還原糖，而還原糖是林可霉素發(fā)酵中的速效碳源，在中后期使用液化液的發(fā)酵罐卻比使用液化糖的長勢更好，因為林肯鏈霉菌可能存在利用短鏈淀粉的酶系，而液化液的主要成分是糊精和低聚糖，液化液中的速效碳源和持續(xù)碳源的比例相對于液化糖來說，可能更利于林肯鏈霉菌在發(fā)酵過程中的生長以及林可霉素的釋放.

圖5 實驗罐和對照罐菌絲形態(tài)

圖6 實驗罐和對照罐3個批次的發(fā)酵效價

通過在基礎培養(yǎng)基及補糖中用液化液代替液化糖進行林可霉素發(fā)酵的實驗，發(fā)現(xiàn)在基礎培養(yǎng)基中用液化液代替液化糖進行發(fā)酵，最終放罐平均發(fā)酵效價提高了8.6%;在基礎培養(yǎng)基及補糖中均用液化液代替液化糖進行發(fā)酵，最終放罐平均發(fā)酵效價提高了12.4%.因此，使用液化液代替液化糖進行林可霉素的發(fā)酵，可降低生產(chǎn)林可霉素的成本，提高效率及產(chǎn)能，今后將在生產(chǎn)上對該工藝進行驗證及完善.

［1］ Rajeswaran M，Srikrishnan T.Crystal andmolecular structure and absolute configuration of lincomycin hydrochloridemonohydrate ［J］.Carbohydr Res，2004，339(12):2111－2115.

［2］Olsovska J，Jelinkova M，Man P.High－through put quantification of lincomycin traces in fermentation broth of geneticallymodified streptomyces spp.comparison of ultra performance liquid chromatography and high－performance liquid chromatography withUV detection［J］.Journal of ChromatographyA，2007，1139:214－220.

［3］Spizek J，Rezanka T.Lincomycin，cultivation of producing strains and biosynthesis［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2004，63(5):510－519.

［4］Gerasimova S，Berezina E.Cytomorphological study of lincomycin toxicity［J］.Antibiotiki，1977，22(6):539.

［5］王忠，王立琦.林可霉素在獸醫(yī)臨床上的應用進展［J］.獸醫(yī)導刊，2010(2):42－44.

［6］董明，邵瓊芳.林可霉素發(fā)酵液絮凝過濾研究［J］.江西師范大學學報:自然科學版，2002，26(4):372－374.

［7］何家駿，樊世從.液化糖代替葡萄糖在林可霉素發(fā)酵中的應用［J］.中國醫(yī)藥工藝雜志，1992，23(7):296.

［8］葉萬榮.旋光法測定發(fā)酵液中林可霉素的含量［J］.醫(yī)藥工業(yè)，1987，18(2):76－77.

［9］李瑸.多元萃取體系提取林可霉素的熱力學研究［D］.河北:河北工業(yè)大學，2004:10－11.

［10］北京大學生物系生化教研室.生物化學實驗指導［M］.北京:高等教育出版社，1986:92－96.

［11］孫婉菊，王筱蘭.廢棄菌體水解液作氮源發(fā)酵產(chǎn)腈水合酶的研究［J］.江西師范大學學報:自然科學版，2013，37(5):530－534.

［12］李嘯，儲炬，張嗣良，等.玉米漿對林可鏈霉菌的代謝特性及形態(tài)的動態(tài)影像［J］.工業(yè)微生物，2009，39(6):16－19.