張欣桐， 蒲 晨， 杜轉(zhuǎn)環(huán)， 李 盼， 劉景卓， 甄玲玲， 馬 莉

膿毒癥是宿主對(duì)感染產(chǎn)生的全身性炎癥反應(yīng)失調(diào)，常常引起多器官功能障礙甚至危及生命[1]。肝臟是最早累及的器官之一，重癥感染、炎癥反應(yīng)的過(guò)度激活、微循環(huán)衰竭及治療副作用均可引起急性肝損傷[2]，膿毒癥中急性肝損傷患者占總患病人數(shù)的34%～46%[3]，減輕肝損傷可顯著降低膿毒癥患者的死亡率[4-5]。目前尚無(wú)針對(duì)膿毒癥急性肝損傷有效的治療方法，積極探討其相關(guān)分子機(jī)制，可能為膿毒癥急性肝損傷的治療提供新的思路和方法。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3， STAT3)信號(hào)通路與酪氨酸磷酸化信號(hào)通路偶聯(lián)，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，參與各類(lèi)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。Wang等[6]研究人員采用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)大鼠膿毒癥急性肺損傷，發(fā)現(xiàn)大鼠血清中白細(xì)胞介素-6(interleukin 6， IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1β， IL-1β)等炎性細(xì)胞因子水平均上調(diào)(P<0.05)，肺組織磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3， p-STAT3)蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，研究證實(shí)，STAT3信號(hào)通路與膿毒癥密切相關(guān)。而細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3， SOCS3)屬于SOCS家族，SOCS蛋白通過(guò)與磷酸化STAT相互作用來(lái)阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，是STAT信號(hào)通路重要的負(fù)調(diào)控因子[7-9]。

近年研究[10]表明，β1-受體阻滯劑可抑制炎癥反應(yīng)，改善膿毒癥預(yù)后。艾司洛爾為超短效選擇性β1-受體阻滯劑，通過(guò)與兒茶酚胺競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合β-受體，從而抑制交感神經(jīng)活動(dòng)的過(guò)度興奮。一項(xiàng)Meta分析[11]表明，艾司洛爾提高膿毒性休克和膿毒癥患者的生存率。既往研究多局限于艾司洛爾對(duì)膿毒癥心肌功能障礙的影響[12]，然而艾司洛爾對(duì)膿毒癥急性肝損傷的作用機(jī)制尚不明確。盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation puncture, CLP)法操作簡(jiǎn)單，具有與人類(lèi)膿毒癥病程進(jìn)展高度相似的特點(diǎn)，是膿毒癥造模的經(jīng)典方法。本研究擬采用CLP法建立膿毒癥大鼠模型，探究艾司洛爾對(duì)膿毒癥急性肝損傷的保護(hù)作用及其可能的信號(hào)通路，從而為膿毒癥急性肝損傷的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 從蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(中國(guó)甘肅)購(gòu)入健康雄性SPF級(jí)Sprague-Dawley大鼠48只(體質(zhì)量250～300 g)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為三組，包括假手術(shù)組(Sham組，n=16)，盲腸結(jié)扎穿孔組(CLP+NS組，n=16)和艾司洛爾干預(yù)組(CLP+ES組，n=16)。所有方案均根據(jù)《美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院準(zhǔn)則》進(jìn)行，本研究已得到蘭州大學(xué)第二醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：D2021-253)。

1.2主要試劑 戊巴比妥鈉(上海中秦化學(xué)試劑有限公司)、艾司洛爾(齊魯制藥有限公司)、 酶聯(lián)免疫試劑盒(上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司)、BCA 蛋白測(cè)定試劑盒(Biosharp)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)活性檢測(cè)試劑盒、SOCS3一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔 IgG二抗均購(gòu)自Proteintech公司，STAT3、p-STAT3一抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膿毒癥動(dòng)物模型的建立 如前所述[13]，CLP法建立膿毒癥大鼠模型：向大鼠腹膜內(nèi)注射1%戊巴比妥溶液(40 mg/kg)進(jìn)行麻醉，腹部備皮、消毒、鋪無(wú)菌洞巾。然后沿腹中線切開(kāi)1～2 cm縱行切口并暴露盲腸，用4.0絲線在距盲腸末端1 cm處鈍性分離并結(jié)扎盲腸，用18G注射器針頭穿透盲腸2次并擠出少許腸內(nèi)容物至大鼠腹腔內(nèi)，回納盲腸并逐層關(guān)腹。為確保一致性，所有CLP操作均由同一操作員執(zhí)行，術(shù)后給予大鼠皮下注射無(wú)菌生理鹽水(20 mL/kg)進(jìn)行液體復(fù)蘇。其中，CLP+NS組和CLP+ES組中大鼠行盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)。Sham組大鼠行盲腸探查術(shù)，即翻動(dòng)盲腸后關(guān)腹。

1.2.2 頸內(nèi)靜脈置管 沿大鼠左頸部皮膚從左上至右下切開(kāi)一1.5 cm斜行切口，暴露并鈍性分離左側(cè)頸內(nèi)靜脈，縫線結(jié)扎血管遠(yuǎn)心端，用眼科剪剪一“V”形切口并將預(yù)沖肝素鈉鹽水的一次性硬脊膜外麻醉導(dǎo)管成功置入，固定導(dǎo)管并用濕潤(rùn)紗布覆蓋手術(shù)切口。

1.3.3 給藥 CLP+ES組大鼠經(jīng)頸內(nèi)靜脈給予15 mg/(kg·h) 艾司洛爾稀釋液持續(xù)微量泵入6 h。Sham組和CLP+NS組大鼠經(jīng)頸內(nèi)靜脈持續(xù)微量泵入等質(zhì)量生理鹽水6 h。液體輸注完成后，拔出硬脊膜外麻醉導(dǎo)管并結(jié)扎血管、縫合手術(shù)切口后大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.3標(biāo)本采集和相關(guān)因子檢測(cè)

1.3.1 標(biāo)本采集 術(shù)后6 h、24 h，分別取8只大鼠進(jìn)行心臟取血，室溫下靜置采血管1 h后在4 ℃、3000 r/min、5 min的條件下進(jìn)行離心，收集血清并保存在-80 ℃冰箱，用于檢測(cè)肝功能指標(biāo)。大鼠麻醉后行安樂(lè)死，生理鹽水灌洗肝臟，收集肝組織標(biāo)本。其中1/3用于病理學(xué)觀察，1/3用于檢測(cè)肝組織炎性細(xì)胞因子水平，1/3用于檢測(cè)STAT3信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白表達(dá)情況。

1.3.2 HE染色進(jìn)行病理學(xué)觀察 采用4%多聚甲醛緩沖液固定肝組織，脫水、包埋、制作石蠟切片及HE染色，并在光鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.3.3 生化分析儀檢測(cè)肝功能指標(biāo) 術(shù)后6 h、24 h，生化分析儀檢測(cè)血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase， AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase， ALT)水平。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)檢測(cè)肝組織炎性細(xì)胞因子水平 電子天平對(duì)各組肝組織稱(chēng)質(zhì)量并置于EP管中，按比例依次向EP管中加入PBS緩沖液,用電動(dòng)勻漿器在冰上充分研磨大鼠肝組織,直至形成肝組織混懸液。然后在4 ℃、5000 r/min、10 min的條件下離心肝組織混懸液,收集淡黃色上清液即肝組織勻漿。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)術(shù)后6 h、24 h肝組織勻漿中高遷移率族蛋白B-1(hig h mobility group box-1 protein， HMGB-1)和IL-6水平。

1.3.4 Western blot檢測(cè)STAT3信號(hào)通路標(biāo)志蛋白表達(dá)水平 電子天平對(duì)各組肝組織稱(chēng)質(zhì)量并置于EP管中，按比例依次向EP管中加入RIPA裂解液,用電動(dòng)勻漿器在冰上充分研磨大鼠肝組織,直至形成肝組織混懸液。然后在4 ℃、5000 r/min、10 min的條件下離心肝組織混懸液,收集淡黃色上清液即肝組織勻漿。BCA檢測(cè)各組肝組織勻漿的蛋白濃度，肝組織勻漿蛋白充分變性后，通過(guò)在SDS-PAGE凝膠上電泳對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離，采用濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移到經(jīng)甲醇活化的PVDF膜上，接著在搖床上常溫封閉抗體1.5 h，4 ℃孵育一抗STAT3、p-STAT3、SOCS3過(guò)夜，1×TBST稀釋液洗滌3次后常溫孵育二抗2 h，再用1×TBST稀釋液洗滌3次，最后采用ECL發(fā)光液在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中對(duì)PVDF膜進(jìn)行曝光成像，并應(yīng)用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，進(jìn)行蛋白定量分析。

2 結(jié)果

2.1艾司洛爾減輕肝組織病理?yè)p傷程度，發(fā)揮保護(hù)肝組織作用 鏡下可見(jiàn)，術(shù)后6 h、24 h Sham組肝組織中無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞排列整齊，肝界板完整，肝竇清晰可見(jiàn)；而CLP+NS組肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肝細(xì)胞形態(tài)紊亂，中央靜脈與匯管區(qū)之間形成橋接壞死，胞漿透明，液泡變性，且24 h較6 h病理?yè)p傷程度更重；術(shù)后6 h、24 h CLP+ES組較CLP+NS組肝細(xì)胞壞死及炎性浸潤(rùn)程度均明顯好轉(zhuǎn)，肝細(xì)胞排列基本趨于整齊，細(xì)胞形態(tài)基本正常，液泡變性明顯改善。見(jiàn)圖1。

2.2艾司洛爾降低血清ALT、AST水平 與Sham組比較，CLP+NS組大鼠血清ALT、AST水平在術(shù)后6 h、24 h明顯升高，于術(shù)后24 h達(dá)高峰(P<0.05)。CLP+ES組ALT、AST水平在術(shù)后6 h、24 h同樣出現(xiàn)升高，各時(shí)間點(diǎn)ALT、AST水平均低于CLP+NS組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

注：黑色箭頭表示炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，紅色箭頭表示肝細(xì)胞壞死，黃色箭頭表示液泡變性；Sham組為假手術(shù)組，CLP+NS組為盲腸結(jié)扎穿孔組，CLP+ES組為艾司洛爾干預(yù)組圖1 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化(HE，×200)

表1 各組大鼠血清ALT、AST水平

2.3艾司洛爾抑制肝組織中炎癥因子HMGB-1、IL-6的釋放 與Sham組比較，CLP+NS組大鼠肝組織勻漿中HMGB-1、IL-6水平在術(shù)后6 h、24 h明顯升高(P<0.05)，于24 h達(dá)高峰。CLP+ES組HMGB-1、IL-6在術(shù)后6 h、24 h同樣出現(xiàn)升高,各時(shí)間點(diǎn)HMGB-1、IL-6水平均低于CLP+NS組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肝組織勻漿IL-6及HMGB-1水平

2.4艾司洛爾抑制p-STAT3蛋白表達(dá)，增加SOCS3蛋白表達(dá) 術(shù)后6 h、24 h，與Sham組比較, CLP+NS組p-STAT3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。SOCS3蛋白表達(dá)趨勢(shì)與p-STAT3蛋白恰恰相反(P<0.05)。術(shù)后6 h，CLP+ES組p-STAT3蛋白表達(dá)水平較CLP+NS組明顯降低(P<0.05)，SOCS3蛋白表達(dá)水平較CLP+NS組明顯升高(P<0.05)。術(shù)后24 h，與CLP+NS組比較，CLP+ES組p-STAT3蛋白表達(dá)水平有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SOCS3蛋白表達(dá)水平有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 各組大鼠肝組織STAT3信號(hào)通路蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠術(shù)后6 h、24 h肝組織p-STAT3及SOCS3蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

從本質(zhì)上講，膿毒癥是一種由機(jī)體免疫反應(yīng)過(guò)度激活引起的炎癥性疾病[14]，機(jī)體交感神經(jīng)興奮，β-受體被活化，釋放大量炎性細(xì)胞因子，引起強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)，造成重要器官損傷。既往研究[15-16]證實(shí)，艾司洛爾在膿毒癥中應(yīng)用廣泛，不僅減慢膿毒癥患者心率、減輕心肌損傷和改善左心室的舒張功能，而且可以抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡過(guò)程[17]。目前，艾司洛爾是否對(duì)膿毒癥急性肝損傷有保護(hù)作用的相關(guān)研究較少?；诖?，本研究初步探討艾司洛爾通過(guò)STAT3信號(hào)通路，減少炎性細(xì)胞因子的釋放，改善膿毒癥急性肝損傷程度，旨在完善艾司洛爾在膿毒癥中的臟器保護(hù)作用，以期為臨床治療膿毒癥提供新的思路和方法。

機(jī)體釋放過(guò)量炎性細(xì)胞因子在急性肝損傷的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，加重肝組織的損傷程度。膿毒癥致急性肝損傷時(shí)，肝細(xì)胞被過(guò)量炎性細(xì)胞因子破壞，引起ALT、AST釋放入血。肝臟中巨噬細(xì)胞-Kupffer細(xì)胞被激活，可釋放IL-6等炎性細(xì)胞因子，而IL-6是膿毒癥早期釋放的主要炎性細(xì)胞因子之一,可激活STAT3信號(hào)通路[18-19]，促進(jìn)HMGB-1等因子釋放，從而調(diào)節(jié)膿毒癥等病理?xiàng)l件下多種細(xì)胞因子水平[20]。艾司洛爾在膿毒癥模型中具有較好的抗炎潛力[21-22]。本研究結(jié)果顯示，艾司洛爾能明顯下調(diào)血清ALT、AST水平，減少肝組織炎性細(xì)胞因子HMGB-1、IL-6釋放，提示艾司洛爾可減輕CLP誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷。研究[17]證實(shí)，與膿毒癥大鼠肝組織相比，艾司洛爾干預(yù)后肝臟病理切片表現(xiàn)為正常肝小葉，肝竇中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，肝臟僅表現(xiàn)為中央靜脈缺血，證實(shí)艾司洛爾能減輕膿毒癥大鼠炎癥，保護(hù)肝功能，這一結(jié)果在本研究中得到驗(yàn)證。

STAT3蛋白是炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)之一，STAT3信號(hào)通路的活化與多種炎癥疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如潰瘍性結(jié)腸炎[23]、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[24]及膿毒癥[6]等，尤其在膿毒癥介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中作用顯著，該信號(hào)通路對(duì)γ-干擾素、腫瘤壞死因子-α等促炎因子的產(chǎn)生具有重要影響。為了明確艾司洛爾與膿毒癥急性肝損傷的具體作用機(jī)制，本研究檢測(cè)膿毒癥大鼠肝組織中STAT3信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白STAT3、p-STAT3和SOCS3的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，艾司洛爾可下調(diào)肝組織p-STAT3蛋白表達(dá)水平，同時(shí)SOCS3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，但STAT3蛋白表達(dá)水平并無(wú)明顯差異。提示艾司洛爾可通過(guò)抑制STAT3磷酸化，影響STAT3信號(hào)通路，改善膿毒癥急性肝損傷。Samar Imbaby等[25]研究發(fā)現(xiàn)，抑制STAT3通路可減少炎性細(xì)胞因子的釋放，減輕組織損傷，最大程度地避免膿毒癥大鼠器官衰竭的發(fā)生。研究[26]發(fā)現(xiàn)，肝組織中p-STAT3蛋白表達(dá)增多可加重大鼠肝損傷，SOCS3蛋白表達(dá)上調(diào)有利于急性肝損傷的恢復(fù)。STAT3蛋白磷酸化的失活可減少p-STAT3蛋白的表達(dá)，明顯抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激過(guò)程，增加膿毒癥大鼠的存活率、減少肺損傷。上述研究與本研究中艾司洛爾抑制p-STAT3蛋白表達(dá)水平，保護(hù)膿毒癥大鼠肝功能的結(jié)論是一致的。值得注意的是，在本研究結(jié)果中，CLP+ES組p-STAT3、SOCS3蛋白表達(dá)水平在術(shù)后24 h較CLP+NS組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。究其原因，考慮與艾司洛爾的藥物半衰期較短，干預(yù)時(shí)間僅為6 h有關(guān)。

已知雷帕霉素是STAT3蛋白的特異性抑制劑，該藥物可直接抑制膿毒癥大鼠肝、肺組織STAT3的活性和STAT3 mRNA表達(dá)水平[27]。有研究[28]發(fā)現(xiàn)，CLP+雷帕霉素組血清中 ALT、AST 和肝組織中HMGB-1 水平較CLP組明顯下降，而且CLP+雷帕霉素組大鼠存活率較CLP組明顯升高(CLP+雷帕霉素組vs. CLP組為37.5% vs. 70.8%)，表明抑制STAT3能夠保護(hù)膿毒癥大鼠的肝功能，有效提高存活率。王松柏等[29]在CLP造模前向大鼠皮下注射酪氨酸激酶(JAK)抑制劑-AG490或雷帕霉素后，AG490組和雷帕霉素組大鼠血清中肝功能指標(biāo)ALT、AST均明顯下降，兩組大鼠肝組織HMGB-1轉(zhuǎn)錄水平較CLP組均下降。由此猜測(cè)，STAT3信號(hào)通路的上游可能由JAK激活，炎性細(xì)胞因子通過(guò)活化JAK，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游p-STAT3和負(fù)反饋調(diào)節(jié)蛋白-SOCS3蛋白表達(dá)水平，影響急性肝損傷病程。本研究的不足之處在于：該研究尚未應(yīng)用STAT3信號(hào)通路的特異性抑制劑進(jìn)行干預(yù)明確艾司洛爾與該信號(hào)通路的直接關(guān)系，僅能證實(shí)膿毒癥急性肝損傷時(shí)艾司洛爾可通過(guò)STAT3信號(hào)通路保護(hù)肝功能。毋庸置疑，仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明。

綜上所述，艾司洛爾可通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路，減少炎性細(xì)胞因子的釋放，保護(hù)膿毒癥大鼠肝功能。本研究提示，該藥物可能是治療膿毒癥急性肝損傷的新藥物，有利于艾司洛爾更好地應(yīng)用于膿毒癥的臨床治療。