王曉玉,張 穎,劉 雙,王 超,姜軍坡,王 偉,朱寶成, 王世英*

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；2. 河北省畜牧總站，河北 石家莊050035)

NH是雞糞便排放的最主要有害氣體。集約化雞場中產(chǎn)生的大量NH，會影響雞的生產(chǎn)性能，對飼養(yǎng)人員健康及環(huán)境造成嚴(yán)重威脅。降低氨排放量對我國雞養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

在家禽體內(nèi)飼料蛋白的代謝終產(chǎn)物主要是尿酸。典型的蛋雞糞便中氮含量為13～17 g/kg(干基)，其中 60%～75%以尿酸氮形式存在，25%～34%以未消化蛋白氮形式存在，其余以尿素氮和銨氮形式存在。尿酸是雞糞氨排放的主要來源，而尿酸轉(zhuǎn)化為氨的途徑中需要多種酶的參與，其中脲酶是該途經(jīng)中的關(guān)鍵酶。因此利用脲酶抑制劑可降低雞糞便的氨排放量。但目前為止，因飼喂安全性限制，列入《飼料添加劑品種目錄(2013)》中的脲酶抑制劑只有乙酰氧肟酸一個品種。研究開發(fā)產(chǎn)脲酶抑制劑的飼用微生物以及源于飼用微生物的脲酶抑制劑，對養(yǎng)殖業(yè)氨減排具有巨大的實際應(yīng)用價值。本研究以氨氮利用率和脲酶活性抑制率為主要指標(biāo)，從雞糞便中篩選氨氮高效利用并產(chǎn)脲酶抑制劑的芽孢桿菌，以期為氨減排功能微生物飼料添加劑的研究提供菌源。

1 材料與方法

1.1 分離樣品

新鮮雞糞，取自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院養(yǎng)殖場。

1.2 培養(yǎng)基

(1)富集培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，(NH)SO2.0 g，NaCl 1.0 g，MgSO·7HO 1.0 g，KHPO·2HO 1.0 g，F(xiàn)eSO·7HO 0.4 g，微量元素溶液1.0 mL，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 7.2～7.4。115 ℃滅菌30 min。(2)分離培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基+0.1%膽鹽+2.0%瓊脂。115 ℃滅菌30 min。(3)篩選培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，(NH)SO0.5 g，NaCl 1.0 g，KHPO·2HO 0.5 g，MgSO·7HO 0.25 g，微量元素溶液1.0 mL，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 7.2～7.4。其中氨氮含量約為100 mg/L。115 ℃滅菌30 min。(4)微量元素溶液：EDTA 10.0 g，ZnSO1.2 g，CaCl1.5 g，MnCl·4HO 1.0 g，F(xiàn)eSO·HO 2.0 g，(NH)MoO·4HO 1.0 g，CuSO·5HO 1.0 g，CoCl·6HO 1.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。(5)營養(yǎng)肉湯(NB、NA)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，NaCl5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.4。121 ℃滅菌30 min。(6)尿素酚紅培養(yǎng)基：尿素20 g，酚紅1 g，蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.4。121 ℃滅菌30 min。(7)尿素培養(yǎng)基：尿素20 g，蔗糖10 g，KCl 5 g，MgSO0.5 g，0.05% CaCl0.5 g，NaHPO1 g，NaHPO1 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0～8.0。121 ℃滅菌30 min。

1.3 試劑

氨氮利用率測定所用試劑及溶液采用文獻(xiàn)[7]的方法；脲酶活性測定所需試劑及溶液采用文獻(xiàn)[8]的方法。

1.4 氨氮高效利用芽孢桿菌的富集

稱取10 g新鮮雞糞樣品，150 r/min振蕩30 min，打散菌膠團，80 ℃水浴20 min，殺死普通營養(yǎng)細(xì)胞而留存芽孢桿菌。取上清液5 mL接種于裝有50 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)2 d，取1 mL培養(yǎng)液再次接種于富集培養(yǎng)基中，如此反復(fù)連續(xù)富集10代，且每富集2代利用80 ℃水浴20 min殺死營養(yǎng)細(xì)胞。

1.5 氨氮高效利用芽孢桿菌的分離及初篩

吸取上述富集培養(yǎng)液1 mL，10倍梯度稀釋至10。接種10、10、10三個稀釋度的懸浮液于分離培養(yǎng)基平板上，每個平板100 μL，每個稀釋度3個平板，用無菌涂布棒涂布均勻，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。挑取較大的單菌落，采用劃線法進(jìn)行純化，并轉(zhuǎn)接至篩選培養(yǎng)基斜面， 37 ℃培養(yǎng)1～2 d后，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 氨氮高效利用芽孢桿菌的復(fù)篩

1.6.2 氨氮利用率測定樣品制備 將上述無銨種子液接入盛有100 mL篩選培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃，150 r/min培養(yǎng)48 h即為搖瓶發(fā)酵液，用于氨氮利用率測定。

1.6.3 氨氮利用率的測定 氨氮測定采用文獻(xiàn)[7]所示方法進(jìn)行。具體方法：將上述搖瓶發(fā)酵液5 000 r/min離心10 min，取適量上清液(氨氮總含量不超過8 μg，可適當(dāng)稀釋)，加入到10 mL比色管中，加水稀釋至8 mL，加入1.00 mL顯色液和2滴亞硝基鐵氰化鈉溶液，混合均勻，再滴加2滴次氯酸鈉溶液，稀釋至標(biāo)線，充分混勻。顯色60 min后，在波長697 nm處，用光程為10 mm的比色皿，以水為參比測定吸光度。分別以未接種的篩選培養(yǎng)基和接種的不含氮源的培養(yǎng)基作為正負(fù)對照，測定并計算48 h內(nèi)的氨氮利用率。選擇氨氮利用率高的菌株接種至NA斜面，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，4 ℃保存，進(jìn)入后續(xù)篩選步驟。

氨氮濃度計算公式：

式中:ρ為樣品的濃度，以氮計，mg/L；A為樣品的吸光度；A為水的吸光度；a為校準(zhǔn)曲線的截距；b為校準(zhǔn)曲線的斜率；V為所取樣品的體積，mL；D為樣品的稀釋倍數(shù)。

氨氮利用率計算公式：

式中:N為搖瓶發(fā)酵測定樣品的氨氮利用率；ρ為接種的不含氮源培養(yǎng)基的氨氮濃度；ρ為未接種的篩選培養(yǎng)基的氨氮濃度；ρ為搖瓶發(fā)酵測定樣品的氨氮濃度。

1.6.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備按照文獻(xiàn)[7]所示方法進(jìn)行。具體方法：根據(jù)表1，取6支10 mL比色管，分別加入氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用液，用水稀釋至8.00 mL，按1.5.3步驟測量吸光度。以扣除空白的吸光度為縱坐標(biāo)，以其對應(yīng)的氨氮含量(μg)為橫坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時氨氮含量對應(yīng)表Table 1 CorrespondingTable of ammonia nitrogen content during preparation according to standard curve

1.7 產(chǎn)脲酶抑制劑菌株的初篩

篩選出不產(chǎn)脲酶的菌株，從中再篩選產(chǎn)脲酶抑制劑的菌株。

1.7.1 平板初篩 用滅菌竹簽挑取上述篩選得到的氨氮高效利用芽孢桿菌的菌苔，在尿素酚紅培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃“十字”接種，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后觀察“十字”菌苔周圍的顏色變化。挑取周圍未變色的菌苔于NA斜面，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，進(jìn)入后續(xù)篩選步驟。

1.7.2 搖瓶初篩 用滅菌竹簽挑取上述方法初篩得到的斜面菌苔，接種至裝有50 mL尿素培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)基渾濁情況。將培養(yǎng)基不渾濁的菌株用于后續(xù)試驗。

1.8 產(chǎn)脲酶抑制劑菌株的復(fù)篩

1.8.1 大豆脲酶溶液的制備 將當(dāng)年產(chǎn)大豆按豆水比1∶10(g/mL)浸泡過夜，用打漿機制成勻漿后5 000 r/min離心10 min，上清液即為大豆脲酶溶液。大豆脲酶溶液的脲酶活性參照文獻(xiàn)[8]所示方法進(jìn)行測定。

1.8.2 產(chǎn)脲酶抑制物質(zhì)的菌株篩選 將初篩得到的不產(chǎn)脲酶菌株接種至NB培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液于5 000 r/min離心10 min，上清液為脲酶抑制劑待測溶液。其對脲酶活性抑制率采用下列方法測定。

樣品測定(樣品管)：取200 μL大豆脲酶溶液于玻璃試管中，加入200 μL脲酶抑制劑待測溶液，充分混勻，再加入10 mL尿素緩沖液，蓋好試管塞立即搖勻，30 ℃ ± 0.5 ℃水浴30 min ± 10 s。加入10 mL鹽酸溶液，搖勻后迅速冷卻至20 ℃。將試管內(nèi)容物全部轉(zhuǎn)入錐形瓶中，用20 mL水沖洗試管數(shù)次，加入8～10滴混合指示劑，以氫氧化鈉溶液滴定至呈藍(lán)綠色。

陽性對照(管)：除不加入脲酶抑制劑的待測溶液外，其余與樣品測定相同。

空白對照(管)：除不加入脲酶抑制劑的待測溶液外，還要將10mL尿素緩沖液和10mL鹽酸溶液加入的先后順序顛倒，其余與樣品測定相同。

脲酶活性定義：在30 ℃±0.5 ℃和pH 7.0 ± 0.1的情況下，每1 mL溶液每1 min所釋放的氨基氮的質(zhì)量(mg)，表示為U/mL。

脲酶活性計算：

式中：X為溶液的脲酶活性，U/mL；c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；V為空白消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積，mL；V為樣品消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積，mL；14為氮的摩爾質(zhì)量；30為反應(yīng)時間，min；m為試樣體積，0.2 mL。

脲酶活性抑制率=

1.9 菌株種屬鑒定

1.9.1 形態(tài)特征 將一定稀釋度的J530菌懸液涂布NA培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)；革蘭氏染色后觀察菌體形態(tài)，并用目鏡測微尺對其大小進(jìn)行測量。

1.9.2 分子鑒定 對菌株J530采用原核生物16SrRNA基因序列通用引物(上游 5′-ACTGGAGGAAGGTGGGGA-3′；下游 5′-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3′)進(jìn)行菌落PCR，其擴增產(chǎn)物測序委托華大基因完成，所得結(jié)果在NCBI進(jìn)行比對，并用MEGA4.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.9.3 生理生化 根據(jù)《常見細(xì)菌鑒定手冊》中的菌株鑒定方法，對菌株J530進(jìn)行以下生理生化試驗：氧化酶試驗，葡萄糖、甘露醇、乳糖利用試驗，V-P反應(yīng)試驗，明膠液化試驗，酪素分解試驗，淀粉水解試驗，脲酶酶反應(yīng)試驗，NaCl耐受試驗，硝酸鹽還原試驗。

1.10 J530菌株雞糞氨減排試驗 將J530菌株接種于50 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃，150 r/min培養(yǎng)24 h，搖瓶發(fā)酵液于6 000 r/min離心10 min，所得沉淀用適量無菌水懸浮制成1.0×10CFU/mL的菌懸液。

稱取200.0 g新鮮雞糞放入1 000 mL廣口瓶中，接入上述菌懸液2.0 mL并充分混勻，使接種后雞糞中J530菌體的含量為1.0×10CFU/g。然后再在廣口瓶里的雞糞上放一個盛有40.0 mL氨氣吸收液的100 mL小燒杯。同時以2.0 mL無菌水代替菌懸液作為對照。蓋好瓶塞，30 ℃靜置5 d后測定雞糞芽孢桿菌含量、脲酶活性、氨氣釋放量、pH及氨氮、尿素、尿酸等含量。雞糞便中芽孢桿菌含量測定，先將雞糞用無菌水制成菌懸液，在80 ℃水浴處理10 min，十倍梯度稀釋后，采用平板活菌計數(shù)法測定。選擇30～300 CFU/皿的平板進(jìn)行菌落計數(shù)。芽孢含量(CFU/g)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂布菌液的體積。脲酶活性采用文獻(xiàn)[8]所示方法測定；雞糞中氨態(tài)氮及雞糞氨氣釋放量檢測采用文獻(xiàn)[11]所示方法；雞糞中尿素、尿酸含量檢測采用文獻(xiàn)[13-14]所示的試劑盒法(試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，編號為C012-1、C013-1)。以上均以糞便絕干含量計算。pH利用pH計對糞便5倍稀釋離心液進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮高效利用芽孢桿菌菌株的篩選

富集培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基均以硫酸銨為唯一氮源，使利用氨氮生長的菌得到富集和分離，氨氮含量約為100 mg/L，由此可通過檢測氨氮剩余量來計算微生物的氨氮利用率。經(jīng)過5次富集，分離和純化培養(yǎng)，共得562個菌株，進(jìn)行編號。將菌株接入篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，測定氨氮利用率，得到氨氮利用率在85%以上的菌株共218個(見圖1)，其中J530氨氮利用率為89.6%。

圖1 不同氨氮利用率菌株數(shù)量分布圖Fig. 1 Distribution of the number of strains with different ammonia utilization efficiency

2.2 產(chǎn)脲酶抑制劑芽孢桿菌的初篩

2.2.1 平板初篩 利用尿素酚紅培養(yǎng)基，從218個氨氮利用率在85%以上的菌株中共得到“十字”菌苔周圍未變紅色菌株47個(見圖2)。尿素酚紅培養(yǎng)基的設(shè)計原理：如果菌株產(chǎn)生脲酶，則菌苔周圍培養(yǎng)基中的尿素被分解，產(chǎn)生的氨使培養(yǎng)基原本6.4的pH升高，超過6.8后酚紅指示劑變色使菌苔周圍開始變紅。該方法僅對產(chǎn)脲酶活性較高菌株具有篩選作用。

圖2 尿素酚紅培養(yǎng)基平板中菌株的生長情況圖中黃色“十字”(*)為不產(chǎn)脲酶菌株， 紅色“十字”(▲)為產(chǎn)脲酶菌株Fig.2 Growth of strains in urea phenol red medium plateThe yellow “cross”(*) is the strain that does not produce urea,and the red “cross” (▲)is the urea-producing strain

2.2.2 搖瓶初篩 利用尿素培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從以上47個菌株中篩選得到J530等23個培養(yǎng)基不變渾濁的菌株，即不產(chǎn)生脲酶而導(dǎo)致不能利用尿素進(jìn)行生長的菌株。尿素培養(yǎng)基以尿素為唯一氮源，培養(yǎng)液不渾濁則表明菌株不能利用尿素作為氮源進(jìn)行生長，即不產(chǎn)生脲酶。

2.3 產(chǎn)脲酶抑制劑芽孢桿菌的復(fù)篩

從23個初篩菌株中篩選得到了其發(fā)酵上清液對脲酶活性抑制率在50%以上的6個菌株(見表2)。其中，J530菌株的發(fā)酵上清液對脲酶活性的抑制率最高，達(dá)到99.3%，其次是J183和J2菌株，抑制率分別達(dá)到88.64%和87.59%。

2.4 菌株的種屬鑒定

2.4.1 菌落菌體形態(tài) 由圖3可見,J530菌株菌落呈不規(guī)則形狀，邊緣不整齊，表面粗糙且略有火山口狀突起，不產(chǎn)生色素；革蘭氏染色結(jié)果為陽性；菌體呈桿狀，大小為0.72～0.8μm×2.34～3.85μm。芽孢呈橢圓狀，中生。

2.4.2 216S rRNA發(fā)育樹的建立 將菌株J530的16SrRNA基因序列測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對，用Mega4.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。菌株J530的16SrRNA基因序列與枯草芽孢桿菌()的16SrRNA基因序列同源性最高。

2.4.3 生理生化 J530菌株生理生化試驗結(jié)果見表3。由表3可看出，菌株J530氧化酶，V-P試驗，明膠液化，酪素水解，淀粉水解，硝酸鹽還原反應(yīng)均呈陽性。脲酶酶反應(yīng)呈陰性?？衫闷咸烟恰⒏事洞己腿樘?，不利用葡萄糖產(chǎn)氣。結(jié)合菌落菌體形態(tài)和16SrRNA系統(tǒng)發(fā)育樹情況，可以確定菌株J530為枯草芽孢桿菌()。

表2 菌株發(fā)酵液上清液對大豆脲酶活性的抑制作用Table 2 Inhibition of soybean urease activity by supernatant of fermentation broth

圖3 J530菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果Fig.3 J530 colony morphology and Gram staining results

圖4 菌株J530的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain J530

表3 J530生理生化試驗結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical test results

2.5 J530菌株雞糞氨減排效果

從表4可知，與對照組相比，5 d后試驗組雞糞便的芽孢桿菌含量提高了50.83倍(<0.01)，脲酶活性降低了83.86%(<0.01)，氨氮含量降低了44.41%(<0.01)，尿素含量提高了28.80%(<0.05)，尿酸含量提高了1.51%(>0.05)，pH降低了1.15(<0.05)，5 d氨氣釋放量減少了67.88%(<0.01)。5 d后試驗組雞糞中芽孢桿菌含量增加說明J530菌株可在雞糞便中生長繁殖，而糞便中脲酶活性降低、pH降低及其它參數(shù)的變化均與此有關(guān)。

分析形成以上結(jié)果的原因，可能是J530菌株在雞糞便中進(jìn)行了生長繁殖，產(chǎn)生的脲酶抑制劑使糞便中的脲酶活性顯著降低，降低了尿素轉(zhuǎn)化為氨的速率，同時微生物的生長也需要消耗大量氨氮，因此糞便中的氨氮含量降低，pH也隨之降低，氨氣釋放量顯著減少。J530菌株的生長、代謝并不影響尿酸至尿素的轉(zhuǎn)化過程，因此糞便中的尿素積累，含量顯著提高。

3 討 論

3.1 產(chǎn)脲酶抑制劑微生物的研究狀況

迄今為止，國內(nèi)外對產(chǎn)脲酶抑制劑微生物的研究很少。林新堅等利用篩選脲酶抑制劑產(chǎn)生菌的模式，獲得了能產(chǎn)生脲酶抑制劑的代號為I36的赭曲霉(Aspergillus ochraceus)，研究了I36菌株產(chǎn)生的脲酶抑制劑I36N對5種水稻田土壤脲酶活性的抑制作用，并進(jìn)一步分析了該脲酶抑制劑的分子結(jié)構(gòu)。但赭曲霉會產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物赭曲霉毒素，可能會污染農(nóng)產(chǎn)品、動物飼料和動物性食品等。因此赭曲霉并不能直接用作菌劑或微生物飼料添加劑，只能通過提取純化的方式得到脲酶抑制劑再進(jìn)行應(yīng)用。而本研究篩選的枯草芽孢桿菌是《飼料添加劑品種目錄(2013)》中可用于任何養(yǎng)殖動物的安全微生物之一。枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生多種消化酶、維生素及活性物質(zhì)，能提高動物生長性能，維護(hù)動物腸道健康，增強機體免疫力，且具有糞便臭氣減排效果。本研究篩選得到了產(chǎn)脲酶抑制劑的枯草芽孢桿菌J530菌株，可用于畜禽糞便堆肥菌劑或微生物飼料添加劑，利用菌株能產(chǎn)生的脲酶抑制物質(zhì)的特點，降低糞便或腸道中脲酶活性，減少尿素或尿酸向氨的轉(zhuǎn)化，達(dá)到養(yǎng)殖業(yè)氨減排目的。本實驗室將進(jìn)一步研究J530菌株產(chǎn)生的脲酶抑制劑的性質(zhì)及其分子結(jié)構(gòu)等。

表4 J530菌劑對雞糞脲酶活性、氨排放的影響Table 4 Effect of J530 on urease activity and ammonia emission in chicken manure

3.2 氨減排菌株的篩選狀況

許多研究者進(jìn)行了畜禽糞便氨減排菌株的篩選，但菌種的富集分離和篩選的具體方法和原理有所差別。如張宏才等以含有氨水為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行氨減排菌株馴化富集，根據(jù)嗅閾值法和計算除氨率，從新鮮雞糞中篩選獲得除臭菌株CCJZ022，對氨氣去除率可達(dá)66.73%。陳華晶等利用含有乙酰胺或乙酸鈉的氨氧化培養(yǎng)基從雞糞便中富集、馴化、分離氨減釋菌，再利用菌液雞糞模擬試驗獲得1株鮑曼不動桿菌()，可使雞糞便氨氣揮發(fā)下降 84.46%。本研究先富集、分離篩選氨氮高效利用菌株，從中再篩選產(chǎn)脲酶抑制劑菌株。一方面將雞糞便中的氨氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白氮、硝基氮等，另一方面抑制糞便中的脲酶活性，減少尿酸氮(或尿素氮)向氨氮的轉(zhuǎn)化，從而降低雞糞便的氨排放，并利用新鮮雞糞的接種試驗證明了該類菌株在氨減排中的應(yīng)用效果。

4 結(jié) 論

從雞糞中篩選得到一株產(chǎn)脲酶抑制劑的芽孢桿菌J530，氨氮利用率為89.6%，對大豆脲酶活性的抑制率高達(dá)99.3%，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌()。該菌株可在雞糞便中生長繁殖，顯著降低雞糞便的脲酶活性、氨氮含量、pH和氨氣釋放量，顯著提高雞糞便尿素含量。