呂世杰，李玉龍,2，張志杰，張子敬，陳付英，黃永震，施巧婷，王二耀,*

(1 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，鄭州 450046；3 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100)

郟縣紅牛主產(chǎn)區(qū)為平頂山市為郟縣、寶豐和魯山三縣，分布于毗鄰的十余個(gè)縣(市、區(qū))，是我國重要的地方優(yōu)良品種。1983年被列入河南優(yōu)良畜禽品種志，1985年10月列入全國八大優(yōu)良黃牛品種，2006年6月被農(nóng)業(yè)部列入國家級畜禽遺傳資源保護(hù)名錄。郟縣紅牛具有毛色紅潤、體型勻稱、適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖性能好等特點(diǎn)，是發(fā)展肉牛產(chǎn)業(yè)和培育優(yōu)良肉牛品種不可多得的遺傳資源。但是，郟縣紅牛的體軀指數(shù)仍低于肉牛的平均體軀指數(shù)，肉用性能指數(shù)也低于肉牛標(biāo)準(zhǔn)[1]。如果要進(jìn)一步提升郟縣紅牛肉用性能和價(jià)值，仍然需要進(jìn)一步對生長性狀進(jìn)行改良提高。

分子育種是郟縣紅牛高效選育的必經(jīng)之路，通過開發(fā)相關(guān)分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種能夠提升育種效率。到目前為止，已研究鑒定出與肉牛生長有關(guān)的基因近80個(gè)[2]。例如LEPR基因[3]和NCAPG-LCORL區(qū)間被發(fā)現(xiàn)與平均日增重顯著相關(guān)[4-5]，PLAG1基因和TMEM68基因分別與屠宰重和初生重顯著相關(guān)[6-7]。

TAFA趨化素樣家族成員1(TAFA1，TAFA Chemokine Like Family Member 1)是能編碼小分子蛋白的TAFA基因家族中的一員，編碼的蛋白在固定位置含有保守的半胱氨酸殘基并與MIP-1 alpha(CC趨化因子家族成員)有關(guān)，其主要在大腦中表達(dá)[8]。該基因位于中國和牛的選擇信號區(qū)域，表明該基因與中國和牛的某些表型性狀形成有關(guān)[9]。但該基因是否與牛的生長性狀相關(guān)還鮮有報(bào)道。本研究選擇該基因進(jìn)行研究，擬探究郟縣紅牛TAFA1基因的遺傳變異及其與生長性狀的關(guān)系，以期為郟縣紅牛高效選育相關(guān)分子標(biāo)記的開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以79頭郟縣紅牛成年母牛為試驗(yàn)對象，群體來源于郟縣紅牛保種場。每頭個(gè)體測量體高、體長、胸圍、腰角寬、坐骨端寬、尻長、十字部高、薦高、胸深、胸寬、體重等11個(gè)生長和體尺性狀。

1.2 DNA提取

通過牛頸靜脈采血采集每頭個(gè)體血樣。使用DNeasy Blood & Tissue試劑盒(Qiagen，德國)提取血液總DNA。每份DNA利用紫外分光光度計(jì)(ND-1000，NanoDrop Technologies，美國)和1%瓊脂糖膠檢測DNA質(zhì)量和完整性，樣品純度要求A260/A280 介于1.8～2.0之間。

1.3 引物設(shè)計(jì)與基因型分析

牛TAFA1基因位于22號染色體，其第一外顯子上存在一個(gè)錯(cuò)義突變r(jià)s137516577(G>C， BTA22:33471934，ARS-UCD 1.2)。該突變可導(dǎo)致氨基酸序列中第4位的結(jié)氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?。本試?yàn)根據(jù)牛TAFA1基因序列(ENSBTAG00000019041，ARS-UCD 1.2)在該突變上下游設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。根據(jù)該SNP位點(diǎn)的測序結(jié)果，判斷每頭個(gè)體的基因型。上游引物序列為5′-GCTCAAAGCCGGGGGTAATTCT-3′，下游引物序列為5′-TATCCCCCACACTCCCCGTAG-3′，PCR產(chǎn)物長度為329 bp。

1.4 TAFA1基因在各組織中表達(dá)量分析

在“Animal Omics Datebase”數(shù)據(jù)庫里查看TAFA1基因在牛各組織間的表達(dá)情況(http://animal.nwsuaf.edu.cn)[10]。基因表達(dá)數(shù)據(jù)由FPKM值表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

計(jì)算rs137516577位點(diǎn)的的基因頻率和基因型頻率，并進(jìn)行哈迪溫伯格平衡檢測。利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，分析該位點(diǎn)基因型對郟縣紅牛生長性狀的影響。

1.6 基因同源性分析

利用Ensembl數(shù)據(jù)庫中已有的牛(Bostaurus)、人(Homosapiens)、豬(Susscrofa)和小鼠(Musmusculus)和綿羊(Ovisaries)的TAFA1蛋白質(zhì)序列(序列號依次為ENSBTAP00000025342, ENSP00000418575, ENSMUSP00000074589, ENSSSCP00000060570, ENSOARP00020029279)，應(yīng)用EMBL-EBI的Clustal W在線軟件(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)[11]，對上述序列進(jìn)行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 TAFA1基因PCR擴(kuò)增片段測序結(jié)果

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行反向測序，通過測序結(jié)果查驗(yàn)每頭牛的基因型(詳見圖1)。本研究群體共有GG和GC兩種基因型，分別為18頭和61頭牛，GG基因型頻率為0.23，GC為0.77。G等位基因頻率為0.61，C為0.39。χ2 檢驗(yàn)值為 31.242，P值小于0.05，表明該位點(diǎn)在本群體中不處于Hard-Wein-berg平衡狀態(tài)。

圖1 TAFA1基因不同基因型的測序峰圖

2.2 TAFA1基因多態(tài)位點(diǎn)與郟縣紅牛生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

對郟縣紅牛11個(gè)生長和體尺性狀進(jìn)行測定，并對TAFA1基因rs137516577 SNP位點(diǎn)不同基因型與這些性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，該位點(diǎn)與體長、腰角寬、坐骨端寬、尻長和體重等性狀顯著相關(guān)。GC型個(gè)體的生長和體尺性狀均高于GG型個(gè)體(詳見表1)。

2.3 TAFA1基因在牛中的組織表達(dá)分析

根據(jù)“Animal Omics Datebase”數(shù)據(jù)庫中的不同牛組織RNA-seq數(shù)據(jù)，查看TAFA1基因的組織表達(dá)情況(圖2)。TAFA1基因在腦組織中高表達(dá)，其中在大腦中表達(dá)最高(FPKM為10.69)，在下丘腦中表達(dá)次之(FPKM為4.40)。

2.4 TAFA1基因同源性分析

牛TAFA1基因共編碼133個(gè)氨基酸，同源性分析表明牛與人、小鼠、豬、綿羊的氨基酸序列相似度分別為99.25%、98.50%、98.50%和100.00%，證實(shí)該基因在進(jìn)化過程中十分保守(詳見圖3)。

表1 rs137516577 SNP位點(diǎn)不同基因型與郟縣紅牛生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

圖2 TAFA1基因在牛不同組織中的表達(dá)情況(標(biāo)示的數(shù)字為FPKM值)

圖3 不同物種TAFA1氨基酸序列比對

3 討論

本研究通過TAFA1基因上錯(cuò)義突變r(jià)s137516577不同基因型與郟縣紅牛生長性狀的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)與體長、腰角寬、坐骨端寬、尻長和體重等性狀顯著相關(guān)，暗示該基因可能參與調(diào)控郟縣紅牛生長，該突變位點(diǎn)可以作為郟縣紅牛生長選育的分子標(biāo)記。

TAFA1基因位于牛22號染色體的32～33 Mb。該區(qū)域上存在一個(gè)中國西門塔爾牛18月齡體重相關(guān)的QTL(QTL_193800，BTA22: 32709940-32709944)[12-13]，間接表明TAFA1基因可作為牛生長性狀相關(guān)候選基因。目前關(guān)于TAFA1基因的功能研究還較少，不過研究認(rèn)為TAFA家族基因?qū)ι窠?jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)具有重要作用，在小鼠中能夠影響運(yùn)動(dòng)、食物攝入等生理學(xué)活動(dòng)[14]。Xia等人也證實(shí)了TAFA1基因在小鼠中具有調(diào)控采食的功能[15]。此外，研究表明TAFA5基因可以促進(jìn)人胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[16]。同源性分析結(jié)果顯示，該基因在牛、小鼠、豬、綿羊等物種中氨基酸序列相似性極高，同源蛋白在進(jìn)化過程屬于序列保守性，進(jìn)一步說明該基因?qū)Σ溉閯?dòng)物的重要性和功能的一致性。本研究也通過測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)TAFA1基因在牛大腦中高表達(dá)，這與人和小鼠中的研究結(jié)果也是一致的[8]。所以，我們推測TAFA1或可通過影響采食或肌肉、骨細(xì)胞的增殖影響牛的生長。但是，該結(jié)論還需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究中，由于樣品缺乏系譜信息、飼養(yǎng)環(huán)境等可能影響表型的其他因素，統(tǒng)計(jì)模型中未能將這些因素作為因子帶入模型，可能會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。在本群體中，該SNP位點(diǎn)不處于Hard-Weinberg平衡狀態(tài)，可能為人工選擇所致。不過，在本群體中未發(fā)現(xiàn)CC基因型，這可能與樣本量偏低有關(guān)。因此，相關(guān)結(jié)果需要在大群體中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究檢測了TAFA1基因上的1個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs137516577在郟縣紅牛群體中等位基因的分布情況，并通過與生長和體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)該多態(tài)位點(diǎn)與體長、腰角寬、坐骨端寬、尻長和體重等性狀顯著相關(guān)，且GC型個(gè)體均顯著高于GG型。研究表明，該SNP位點(diǎn)可作為郟縣紅牛生長性狀選育的分子標(biāo)記，用于郟縣紅牛的品種改良。