楊 陽，田丹丹，樊曉慧

(西北婦女兒童醫(yī)院中醫(yī)科，陜西 西安 710061)

疼痛已成為危害人類健康的重大疾病之一，其發(fā)病普遍，嚴(yán)重影響人類身心健康。炎性痛是持續(xù)的傷害性超敏反應(yīng)，包括由炎癥細(xì)胞因子、組織損傷和神經(jīng)損傷引起的損傷部位和鄰近組織的疼痛和痛覺過敏[1]。目前，常規(guī)鎮(zhèn)痛藥是治療炎性疼痛的主要藥物，并取得了一定的療效，但是嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生限制了療效。因此，有必要找到更有效和更新的對抗炎癥性疼痛的策略。

炎性痛發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要與外周系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關(guān)。高遷移率蛋白(High mobility group box-1，HMGB1)是一種典型的損傷相關(guān)因子，近年來，HMGB1參與了多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2]。有關(guān)文獻(xiàn)表明，通過抗HMGB1單克隆抗體抑制HMGB1已被證明對癲癇、創(chuàng)傷性腦損傷、中風(fēng)、帕金森病和阿爾茨海默病治療有效[3]。研究表明，在CFA引起的炎癥性疼痛期間，TLR4表達(dá)增加，在這一過程中，外周炎癥通過TLR4刺激腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞的激活，導(dǎo)致NF-κB核轉(zhuǎn)錄增加，從而驅(qū)動促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如白細(xì)胞介素-1β等，有助于疼痛過敏的起始和維持[4]。因此，阻斷HMGB1介導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號通路的激活可以改善疼痛的超敏反應(yīng)，這意味著靶向HMGB1通路介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥疼痛，可能是一種很有前途的治療方法。

中樞致敏作用在炎癥性疼痛的過程中起著重要的作用，其中最重要的結(jié)構(gòu)之一是前扣帶皮層(Anterior cingulate cortex，ACC)。越來越多的研究證實(shí)，ACC在疼痛研究中越來越受重視，在人類疼痛相關(guān)信息的處理和動物對有害刺激或組織損傷的行為反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[5]。既往研究也表明，炎癥細(xì)胞因子可以增加前扣帶皮層神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，并顯著增強(qiáng)興奮性突觸傳遞反應(yīng)[6]。

針刺鎮(zhèn)痛是否通過抑制HMGB1介導(dǎo)的炎癥發(fā)揮作用尚未有報道。但有研究已證實(shí)，針灸對炎癥反應(yīng)以及炎癥細(xì)胞因子有一定的調(diào)控作用，提示調(diào)節(jié)相關(guān)炎性信號通路可能是針灸鎮(zhèn)痛的重要效應(yīng)機(jī)制。本研究通過踝關(guān)節(jié)注射完全弗氏佐劑(Complete freund’s adjuvant,CFA)成功建立炎性痛模型，以HMGB1/TLR4信號通路為切入點(diǎn)，觀察電針干預(yù)對急性炎性痛小鼠熱刺痛及機(jī)械痛閾值、HMGB1/TLR4信號通路在前扣帶皮層ACC腦區(qū)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究針刺鎮(zhèn)痛的機(jī)制提供新的方向。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：SPF級雄性6～8周齡C57BL/6小鼠共領(lǐng)取3批，每批每組8只，體重約為20～25 g，飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)藥理學(xué)教研室動物房。動物領(lǐng)取后進(jìn)行隨機(jī)化分組喂養(yǎng)，室內(nèi)溫度穩(wěn)定在20～25 ℃，濕度穩(wěn)定在50%左右，光照12 h晝夜循環(huán)，在開始實(shí)驗(yàn)前將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，在實(shí)驗(yàn)過程中保持所有動物自由活動。之后進(jìn)行的行為學(xué)檢測全部在上午實(shí)施。本次實(shí)驗(yàn)動物的使用及所有的實(shí)驗(yàn)方案都經(jīng)過空軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑與儀器：全自動電泳儀(廣州科昊公司)；全自動多功能酶標(biāo)儀(德國 Thermo 公司)；Bio-Rad 680 酶標(biāo)儀(美國 BioRad 公司)；冰凍切片機(jī)(德國 Leica 公司)；Tanon 4200 發(fā)光成系統(tǒng)(上海 Tanon 公司)；CFA(美國 Sigma 公司)；Glycyrrhizin(上海 Selleckchem 公司)；Mouse 抗-β-actin(美國 Sigma 公司)；Rat 抗-HMGB1 (美國 Abcam 公司)；Rat 抗-IL-1β (美國 Abcam 公司)；Rat 抗-TLR4 (美國 CST 公司)。

1.1.3 配制溶液：制備轉(zhuǎn)膜液：天平上稱3.03 g Tris及14.4 g甘氨酸放置在器皿中，往其中加去離子水使其溶解，然后定容至800 ml，后加入200 ml甲醇，充分混勻備用。制備麗春紅溶液：在天平上稱取0.2 g麗春紅放置于器皿中，往其中加去離子水使其溶解，然后用量筒定容至90 ml，后倒入約10 ml冰乙酸充分混勻，常溫保存?zhèn)溆谩Ｖ苽銹BST緩沖液：用器皿制備500 ml PBS緩沖液，然后往其中加入500 μl吐溫-20，充分混勻待用。備牛奶封閉液：將100 ml的PBST緩沖液放置于器皿中，放在搖床上左右擺動，緩慢往其中加5 g脫脂奶粉，混勻至沒有顆粒感。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立動物模型及其分組：將C57BL/6小鼠隨機(jī)分成五組?？瞻捉M(Control)、模型組(Model)，電針組(Model+EA)、抑制劑組(Model+GLY)、電針加抑制劑組(Model+GLY+EA)，每組各8只小鼠。建立炎性痛小鼠模型參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]，以75 %酒精消毒左踝關(guān)節(jié)周圍皮膚，后向左踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射10 μl CFA。常規(guī)24 h內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為左后肢踝部出現(xiàn)紅腫，行動減少，跛行或抬腿不能著地為造模成功。

1.2.2 針刺方法：按照相關(guān)動物穴位圖譜選取“足三里”穴，用一次性使用無菌針灸針0.18 mm×10 mm進(jìn)行針刺[8]。針刺完成后，接通電針儀的電源連接在針柄上，電針時間15 min，強(qiáng)度為0.3 mA，以小鼠肌肉輕度抽搐為標(biāo)準(zhǔn)對小鼠進(jìn)行電針治療。電針結(jié)束后，小鼠恢復(fù)30 min后，再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。EA組小鼠連續(xù)治療7 d。

1.2.3 GLY的劑量與用法：GLY溶于2%二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)中制成溶液，從CFA注射1 h后開始連續(xù)腹腔注射GLY4 mg/(ml·d),7 d，與EA治療時間一致。

1.2.4 熱敏痛實(shí)驗(yàn)：將小鼠放置于紅外熱爪痛覺測試儀平臺的鼠盒內(nèi)，自由活動1 h后開始實(shí)驗(yàn)。將熱輻射光源發(fā)射中心對準(zhǔn)小鼠左后足，自照射開始起計時，記錄迅速抬起后肢的時間，即為縮足反射潛伏期(Paw withdrawal latency，PWL)。每只小鼠重復(fù)測試5次，間隔時間不少于 5 min。設(shè)定照射自動停止時間為20 s，以免造成足底損傷[9]。

1.2.5 機(jī)械痛實(shí)驗(yàn)：將小鼠放置于Von Frey纖維絲測痛儀工作臺的鼠盒內(nèi)，自由活動1 h后開始測試。參照文獻(xiàn)[10]，按照其試驗(yàn)方案，測得正常小鼠50%機(jī)械痛縮足閾值為0.4 mN(#2.44)filament。調(diào)整Von Frey纖維絲的伸出長度，垂直刺激小鼠左后足底中央，以縮足反射或者舔足反應(yīng)為陽性反應(yīng)。重復(fù)6次，每次刺激持續(xù)時間不超過8 s，間隔時間不少于15 s，陽性反應(yīng)率=陽性反應(yīng)次數(shù)/6×100%。

1.2.6 冰凍病理切片制備：行為學(xué)檢測結(jié)束后，每組隨機(jī)進(jìn)行心臟灌注，取出全腦放于裝有多聚甲醛的EP管中，4 ℃放置8 h，然后將全腦放置于20%和30%蔗糖水中脫水，最后冰凍切片機(jī)切片，收集腦片，4 ℃保存，免疫熒光染色備用。

1.2.7 免疫熒光：將腦片用含0.3% Triton X-100的濾過的PBS液打孔30 min。打孔完成后，將各組腦片加入標(biāo)記好的24孔板中，加入正常山羊血清封閉液，常溫1 h封閉。封閉完成，吸走封閉液，按照相應(yīng)比例，配制一抗，每孔加入配制好的一抗，放4 ℃冰箱過夜。次日，繼續(xù)孵二抗。將24孔板從4 ℃冰箱取出，放在搖床上搖40 min至2 h進(jìn)行復(fù)蘇。將腦片用濾過的PBS液在打孔板里洗3次×7 min/次。用濾過的PBS為基礎(chǔ)液，按照一定比例，避光配制熒光二抗，避光置于室溫1 h。將腦片用濾過的PBS液在打孔板里洗3次×7 min/次。進(jìn)行貼片，將載玻片按不同的實(shí)驗(yàn)組做好標(biāo)記，再將所有腦片按序貼于載玻片上，稍晾干后，50%的甘油封片，4 ℃避光保存。顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.8 Western blot檢測：①樣品制備：將標(biāo)本從-80 °C冰箱取出后置于冰上，組織稱重，按組織重量(g)與裂解液體積(ml)為1∶9的比例加入裂解液(RIPA 裂解液+1%蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑，使得最終濃度為1 mmol/L)。用電動組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，勻漿每次進(jìn)行10 s，間隔10 s再一次重復(fù)操作，直至無肉眼可見組織碎片即可。將組織勻漿后放于1.5 ml的EP管中，離心機(jī)(12000 r/min，4 ℃)離心20 min后，吸取上清液。蛋白定量：準(zhǔn)備好BCA工作液(A液∶B液=50∶1)于室溫備用，用超純水將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為7個梯度，加入96孔板，做復(fù)孔。再用超純水將上清按原液、1∶5、1∶10、1∶20、1∶50的梯度稀釋，加入96孔板，做復(fù)孔，混勻后于37 ℃孵育30 min。開啟酶標(biāo)儀，讀取OD值。②按操作流程進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉、染色、一抗和二抗。③使用多功能分子成像儀進(jìn)行顯影讀條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 將實(shí)驗(yàn)所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Graph Pad Prism 7.03和SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。組間比較采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠痛敏比較 機(jī)械痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1A)，與正常組相比，模型組小鼠的陽性反應(yīng)率顯著增加(P<0.001)。與模型組相比，電針組小鼠的陽性反應(yīng)率減少(P<0.01)。在熱敏痛實(shí)驗(yàn)中(圖1B)，模型組小鼠縮足反射潛伏期明顯縮短(P<0.001)。與模型組相比，電針組小鼠縮足反射潛伏期顯著增加(P<0.01)。見圖1。

A：小鼠在機(jī)械痛實(shí)驗(yàn)中的陽性反應(yīng)率； B：小鼠在熱敏痛實(shí)驗(yàn)中的縮足反射潛伏期。與正常組比較，*P<0.001；與模型組比較，#P<0.01

2.2 各組小鼠ACC腦區(qū)HMGB1蛋白表達(dá)的比較 在炎性痛的病理過程中，HMGB1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)至關(guān)重要[11]。采用免疫熒光技術(shù)觀察小鼠ACC腦區(qū)HMGB1蛋白表達(dá)的情況。與正常組相比，模型組小鼠ACC腦區(qū)HMGB1蛋白表達(dá)升高。與模型組相比，電針組小鼠ACC腦區(qū)HMGB1蛋白表達(dá)降低。見圖2。

2.3 各組小鼠HMGB1/TLR4信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 采用蛋白免疫印跡法檢測小鼠ACC腦區(qū)HMGB1/TLR4信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組HMGB1、TLR4、IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.001)。與模型組比較，電針組HMGB1、TLR4、IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.01，P<0.001)。見圖3。

HMGB1：紅色，細(xì)胞核Hoechest：藍(lán)色，標(biāo)尺=100 μm

2.4 腹腔注射HMGB1蛋白抑制劑GLY后，各組小鼠痛敏比較 為了驗(yàn)證HMGB1在電針介導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用中的重要作用，使用了一種HMGB1的直接性抑制劑GLY，它可以抑制HMGB1的分裂活性。機(jī)械痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4A)，與正常組相比，模型組小鼠的陽性反應(yīng)率增加(P<0.001)。與模型組相比，電針組、抑制劑組、電針加抑制劑組小鼠的陽性反應(yīng)率減少(P<0.01，P<0.001)。在熱敏痛實(shí)驗(yàn)中(圖4B)，與正常組相比，模型組小鼠縮足反射潛伏期明顯縮短(P<0.001)。與模型組相比，電針組、抑制劑組、電針加抑制劑組小鼠縮足反射潛伏期顯著增加(P<0.01，P<0.001)。見圖4。

A:HMGB1、TLR4、IL-1β蛋白表達(dá)水平，β-actin作為上樣對照；B：HMGB1 蛋白表達(dá)水平；C： TLR4蛋白表達(dá)水平； D： IL-1β蛋白表達(dá)水平。與正常組比較，*P<0.001；與模型組比較，#P<0.01，##P<0.001

A：各組小鼠在機(jī)械痛實(shí)驗(yàn)中的PWL； B:各組小鼠在熱敏痛實(shí)驗(yàn)中的陽性反應(yīng)率。與正常組比較，*P<0.001；與模型組比較，#P<0.01，##P<0.001

2.5 腹腔注射HMGB1蛋白抑制劑GLY后，各組小鼠HMGB1/TLR4信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 為了進(jìn)一步證明HMGB1及其下游蛋白TLR4、IL-1β是否參與了電針介導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用，我們檢測了HMGB1/TLR4通路中各蛋白的表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組HMGB1、TLR4、IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.001)。與模型組比較，電針組HMGB1、TLR4、IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.01，P<0.001)。與電針組比較，電針加抑制劑組HMGB1、TLR4、IL-1β蛋白表達(dá)水平下降更顯著(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。見圖5。

A:HMGB1、TLR4、IL-1β蛋白表達(dá)水平，β-actin作為上樣對照；B：HMGB1蛋白表達(dá)水平；C：TLR4蛋白表達(dá)水平；D： IL-1β蛋白表達(dá)水平。與正常組比較，*P<0.001；與模型組比較，#P<0.001；與電針組比較，$P<0.05，$$P<0.01，$$$P<0.001

3 討 論

炎性痛在中醫(yī)古籍中無明確記載，根據(jù)其癥狀可歸于“痹病”范疇，氣血逆亂，陰陽失調(diào)，氣血運(yùn)化失司，經(jīng)筋失于濡養(yǎng)，“宗筋主束骨而利關(guān)節(jié)也”，筋脈痹阻，不通則痛，關(guān)節(jié)失于榮養(yǎng)，不榮則痛。痹癥可使局部氣血運(yùn)行不暢，唯有用疏散之法，行氣活血為宜，以遠(yuǎn)端循經(jīng)取穴為主，采用強(qiáng)刺激針法，使氣至病所，必要時配合局部的阿是穴行淺刺法，采取對應(yīng)取穴法，包括以左治右，以右治左，以上治下，以下治上等[12]。本研究選用電針“足三里”，探究電針治療對CFA誘導(dǎo)的炎性痛的作用及其中可能機(jī)制。本研究采用機(jī)械痛實(shí)驗(yàn)和熱敏痛實(shí)驗(yàn)觀察電針鎮(zhèn)痛的作用，結(jié)果顯示，模型組小鼠PWL縮短，說明炎性痛模型成功；相較于模型組，電針組PWL顯著增加，說明電針干預(yù)可產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用。

大量的研究已經(jīng)證實(shí)，CFA誘導(dǎo)的炎癥變化發(fā)生在脊髓和皮層區(qū)域，ACC是一個關(guān)鍵的皮層區(qū)域，在疼痛感覺的傳遞中起著重要作用[13-14]。丘腦、杏仁核和其他與疼痛相關(guān)的區(qū)域大腦皮層將傷害性感受信息傳遞到ACC中。有研究表明，減少ACC的活動可以減少疼痛感覺，這表明ACC參與了疼痛的調(diào)節(jié)。ACC中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)增強(qiáng)是導(dǎo)致疼痛感覺的重要原因[15]。本研究顯示，電針治療后，ACC中IL-1β的表達(dá)增加被抑制，這表明電針的鎮(zhèn)痛作用與抑制這些炎癥細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)。

神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用在維持正常的大腦功能中起著重要的作用。然而，它也參與了神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展，包括各種疼痛性疾病[16-17]。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是炎癥介質(zhì)的主要來源之一，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的釋放來增強(qiáng)神經(jīng)元的傳遞[18-19]。小膠質(zhì)細(xì)胞相當(dāng)于大腦和脊髓中的巨噬細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中第一道免疫防線，也是大腦中促炎細(xì)胞因子的主要來源，有害刺激可觸發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子誘導(dǎo)炎癥攻擊、突觸神經(jīng)元損傷[20]。在本研究中，我們觀察到注射CFA的小鼠ACC中小膠質(zhì)細(xì)胞激活，而電針的干預(yù)降低了ACC中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及HMGB1、TLR4等蛋白的表達(dá)。本研究的Western blot和免疫熒光的結(jié)果提示，在CFA注射后ACC中HMGB1、TLR4和IL-1β的表達(dá)顯著增加，而給予電針干預(yù)后HMGB1、TLR4和IL-1β的表達(dá)顯著下降。表明電針發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用是通過抑制HMGB1/TLR4信號通路發(fā)揮作用。為了闡明電針抗炎鎮(zhèn)痛的潛在機(jī)制，我們進(jìn)一步使用了一種HMGB1的直接性抑制劑GLY[21]。研究結(jié)果表明，電針與GLY合用具有協(xié)同作用，共同發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，進(jìn)一步說明電針發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用是通過抑制HMGB1/TLR4信號通路，降低神經(jīng)炎癥。

綜上所述，本研究結(jié)果表明電針發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，有可能是通過抑制HMGB1/TLR4信號通路，降低神經(jīng)炎癥。我們的成果揭示了針刺鎮(zhèn)痛可能的分子機(jī)制，今后我們將進(jìn)一步研究針刺鎮(zhèn)痛其他可能的分子機(jī)制，以及與其他疾病的潛在聯(lián)系。