熊榮波，柳 麗，孟 艷，李 屹，陳來生，鐘啟文，韓 睿

青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院, 青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青海 西寧 810016

通過厭氧消化生產(chǎn)沼氣已成為當(dāng)今可再生能源生產(chǎn)技術(shù)的最佳選擇之一. 該過程不但能有效解決能源短缺問題，且副產(chǎn)物沼液沼渣可作為優(yōu)質(zhì)的有機(jī)肥料，用以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]. 要提高沼氣工程的利用率，使其繼續(xù)發(fā)揮更大的作用，僅使用傳統(tǒng)的畜禽糞便等原料是明顯不足的，新的有潛力原料的發(fā)掘極其重要并且備受關(guān)注. 近年來，不斷涌現(xiàn)出能夠用作沼氣生產(chǎn)的原料，如食物垃圾、城市固體廢物的有機(jī)部分、污水污泥和能源作物等[3-4]. 厭氧消化受多種因素的影響，其中含固率(TS)與接種比(RI/S)是影響啟動(dòng)時(shí)間和基質(zhì)產(chǎn)甲烷能力的直接因素，二者交互影響發(fā)酵的進(jìn)程. 其中，含固率會影響厭氧消化過程中的傳質(zhì)效果，造成體系有機(jī)酸的積累，進(jìn)而影響產(chǎn)氣效果[5]；接種比決定了體系抗有機(jī)酸負(fù)荷的能力，其合理選擇對厭氧消化的運(yùn)行效果和穩(wěn)定性至關(guān)重要[6]. 近年來，有不少研究者對這兩種因素的交互影響進(jìn)行了研究. 例如：甄月月等[7]對尾菜進(jìn)行中溫批式厭氧消化試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在含固率為8%、接種比為0.8時(shí)，累積甲烷產(chǎn)量最大；何品晶等[8]在35 ℃條件下對葉菜類垃圾進(jìn)行厭氧消化試驗(yàn)，結(jié)果表明，含固率為3%、接種比為3.5時(shí)日產(chǎn)甲烷速率最快，含固率為7%、接種比為3.5時(shí)累積甲烷產(chǎn)量最大. Pellera等[9]對4種不同廢棄物進(jìn)行了不同接種比和接種物類型的厭氧發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明，最優(yōu)接種比與發(fā)酵原料和接種物類型有較大關(guān)聯(lián). 因此，不同發(fā)酵原料與接種物的含固率及接種比對厭氧發(fā)酵進(jìn)程有較大影響.

我國是世界上油菜種植面積最大的國家之一. 油菜籽榨油后形成的副產(chǎn)物菜籽餅隨之大量產(chǎn)生，若不充分利用，不僅造成資源浪費(fèi)，還會污染環(huán)境. 菜籽餅的主要成分是粗蛋白，是理想的產(chǎn)沼氣原料[10]. 目前對菜籽餅的研究主要集中在對家禽口糧的應(yīng)用方面[11-12]，也有進(jìn)行厭氧發(fā)酵研究的報(bào)道，如Deepanra等[13]對菜籽餅進(jìn)行了不同含固率(10%～25%)的厭氧發(fā)酵研究，發(fā)現(xiàn)含固率為20%時(shí)的沼氣產(chǎn)量最大；將菜籽餅粕與微生物混合后進(jìn)行厭氧發(fā)酵能夠改善其營養(yǎng)價(jià)值[14]. 但現(xiàn)階段探究含固率和接種比對菜籽餅厭氧消化產(chǎn)甲烷特性的相關(guān)研究較少. 因此，該研究利用全自動(dòng)甲烷潛力測試系統(tǒng)，通過中溫厭氧消化試驗(yàn)，研究含固率和接種比對菜籽餅厭氧消化產(chǎn)甲烷特性的交互影響，并采用修正的Gompertz模型進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，以期為菜籽餅厭氧消化工藝的優(yōu)化和提高菜籽餅資源的綜合利用率提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用菜籽餅取自青海省湟中縣多巴鎮(zhèn)農(nóng)貿(mào)市場，粉碎過80目(0.2 mm)篩備用. 接種物取自青海某公司以牛糞為原料發(fā)酵正常的農(nóng)用沼氣池. 接種污泥取回后，(35±0.5)℃下中溫培養(yǎng)，觀察產(chǎn)氣情況，培養(yǎng)1周左右至不再產(chǎn)氣，以減小背景甲烷產(chǎn)量，將其用作試驗(yàn)接種物. 菜籽餅和接種污泥的理化性質(zhì)見表1.

表1 菜籽餅及接種物特性Table 1 Characteristics of rape cake and inoculum

1.2 試驗(yàn)方案

厭氧發(fā)酵試驗(yàn)采用全自動(dòng)甲烷潛力測試儀〔MultiTalent 203，碧普華瑞環(huán)境技術(shù)(北京)有限公司〕. 500 mL標(biāo)準(zhǔn)批式進(jìn)料反應(yīng)器通過水浴控制為中溫(35±0.5)℃. 設(shè)定每間隔5 min攪拌一次，每次攪拌時(shí)長為1 min.

試驗(yàn)設(shè)置4種不同含固率(以TS計(jì))-2%、4%、6%和8%，3種接種比(RI/S，接種污泥揮發(fā)性固體量與菜籽餅揮發(fā)性固體量的比值)-1.5、2.0和3.0. 如表2所示，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)定的含固率和接種比，分別在不同發(fā)酵瓶中加入對應(yīng)含量的菜籽餅和接種物，用去離子水補(bǔ)充至400 mL. 用接種污泥與去離子水混合液作空白處理，即CK處理. 每組均設(shè)置3個(gè)重復(fù). 從發(fā)酵24 h開始，每3 d采集一次發(fā)酵液樣品，用以測定揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)濃度、堿度、氨氮濃度和pH. 試驗(yàn)選擇在第27天停止，此時(shí)，不同含固率和接種比對整個(gè)體系產(chǎn)氣特性的影響已經(jīng)顯現(xiàn).

表2 各處理下菜籽餅和接種物的添加量Table 2 The amount of rapeseed cake and inoculum added in each treatment group

1.3 測定指標(biāo)及方法

總固體含量(TS)和揮發(fā)性固體含量(VS)采用差重法測定[15]；氨氮濃度采用苯酚次氯酸鈉比色法測定[16]；揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)濃度采用分光光度法測定[17]；pH用pH計(jì)〔pHS-2F，上海儀電科學(xué)儀器股份(中國)有限公司〕檢測；堿度用電位滴定儀〔ZDJ-4A，上海儀電科學(xué)儀器股份(中國)有限公司〕測定；總碳和總氮含量采用元素分析儀(Vario EL Ⅲ，ELEMENTAR，德國)檢測[18]；粗蛋白含量用凱氏定氮法測定[19].

1.4 動(dòng)力學(xué)分析方法

對不同處理下菜籽餅發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，采用目前被認(rèn)為最適于描述產(chǎn)甲烷潛力的修正的Gompertz方程[20]對累積甲烷產(chǎn)量進(jìn)行擬合：

式中：P為累積甲烷產(chǎn)量，mL/g(以VS計(jì))；Pm為最終甲烷潛力，mL/g(以VS計(jì))；Rm為最大產(chǎn)甲烷速率，mL/(g·d)(以VS計(jì))；λ為滯留時(shí)間，d；e為常數(shù)，2.718 282.

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS statistics 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及方差分析，采用鄧肯多重比較法分析各處理組之間的差異，P＜0.05表示具有顯著性差異；使用Origin 2018軟件制圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 含固率和接種比對甲烷產(chǎn)量的影響

由圖1可見，不同含固率和接種比下日產(chǎn)甲烷量差異明顯. 接種比越大，發(fā)酵啟動(dòng)越快.RI/S=3.0時(shí)，各處理組日產(chǎn)甲烷量的最大值出現(xiàn)在前中期(1～11 d)，即發(fā)酵啟動(dòng)后厭氧微生物就開始降解原料中的有機(jī)物，在前中期大部分可利用的有機(jī)物就被消耗完畢；RI/S=1.5時(shí)，各處理組日產(chǎn)甲烷量的最大值出現(xiàn)在發(fā)酵中后期(16～21 d)，前期日產(chǎn)甲烷量較少，啟動(dòng)較慢.這是因?yàn)?，過低的接種比下微生物數(shù)量不夠，體系有機(jī)負(fù)荷增加，產(chǎn)甲烷菌成為優(yōu)勢菌群的時(shí)間較長，導(dǎo)致發(fā)酵起始時(shí)間延長[21]；RI/S=2.0時(shí)，各處理組日產(chǎn)甲烷量的最大值出現(xiàn)在發(fā)酵中期(9～18 d).

圖1 各處理組的日產(chǎn)甲烷量Fig.1 Daily methane production of each treatment group

圖1 亦顯示，含固率對日產(chǎn)甲烷量也有一定影響. 在TS=8%條件下，RI/S=3.0和RI/S=2.0時(shí)，均出現(xiàn)了最大日產(chǎn)甲烷量，分別達(dá)到291.92和307.6 mL；在TS=6%條件下，RI/S=1.5時(shí)出現(xiàn)最大日產(chǎn)甲烷量，為324.82 mL；然而，TS=2%時(shí)，無論在哪種接種比條件下日產(chǎn)甲烷量都較小. 因此，當(dāng)接種比一定時(shí)，較高的含固率下日產(chǎn)甲烷量也相對較高.

中溫條件下菜籽餅在不同含固率和接種比下累積甲烷產(chǎn)量的變化規(guī)律如圖2所示. 由圖2可見：RI/S=2.0和RI/S=3.0時(shí)，TS=6%下累積甲烷產(chǎn)量最高，分別達(dá)到455.58和507.31 mL/g；TS=2%下最低，分別為422.13和397.24 mL/g，均顯著低于同接種比的最大甲烷累積量(P＜0.05).RI/S=1.5時(shí)，TS=4%下累積甲烷產(chǎn)量最高，為454 mL/g；TS=8%下累積甲烷產(chǎn)量最低，為246.95 mL/g，顯著低于其余處理組(P＜0.05).這說明在接種比一定的情況下，各處理組的累積甲烷產(chǎn)量隨含固率的增加呈先升后降的趨勢，與關(guān)正軍等[22]的研究結(jié)果一致，因?yàn)檩^高含固率的發(fā)酵物料會限制中間代謝產(chǎn)物(包括液態(tài)的VFAs和氣態(tài)的H2、CO2等物質(zhì))的傳質(zhì)效率，導(dǎo)致甲烷產(chǎn)量下降.劉丹等[25]發(fā)現(xiàn)，在中溫發(fā)酵體系中，當(dāng)接種物與餐廚廢棄物比為90:10時(shí)，其產(chǎn)甲烷率最大.

圖2 各處理組的累積甲烷產(chǎn)量Fig.2 Cumulative methane production of each treatment group

根據(jù)不同處理下的累積甲烷產(chǎn)量計(jì)算其平均值(I)，由I值計(jì)算同一影響因素不同處理水平下最大累積凈產(chǎn)甲烷量變化的極值(Q)，用以表征該影響因素的變化給最大累積凈產(chǎn)甲烷量帶來變化的大小. 經(jīng)計(jì)算，TS分別為2%、4%、6%、8%時(shí)，I依次為418.88、469.87、475.87、399.53 mL/g；RI/S分別為1.5、2.0、3.0時(shí)，I依次為397.78、449.66、475.67 mL/g. 可見，TS=6%、RI/S=3.0時(shí)為最優(yōu)處理. 僅考慮含固率影響時(shí)，各處理組的累積甲烷產(chǎn)量表現(xiàn)為I6%＞I4%＞I2%＞I8%，即體系產(chǎn)甲烷能力隨含固率的增加呈先升高后降低的趨勢，該條件下最大累積凈產(chǎn)甲烷量變化的極值記作Q1，為76.34；僅考慮接種比時(shí)，各處理組的累積甲烷產(chǎn)量表現(xiàn)為I3.0＞I2.0＞I1.5，即體系產(chǎn)甲烷能力隨接種比的增加而增加，該條件下最大累積凈產(chǎn)甲烷量變化的極值記作Q2，為77.89.Q2＞Q1，表明菜籽餅厭氧發(fā)酵時(shí)，接種比對累積甲烷產(chǎn)量的影響力大于含固率.

2.2 含固率和接種比對菜籽餅厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷潛力的影響和動(dòng)力學(xué)分析

圖2 亦顯示，在高含固率條件下，累積甲烷產(chǎn)量隨接種比的增加而增加. 當(dāng)TS=6%和TS=8%時(shí)，RI/S=3.0下的累積甲烷產(chǎn)量均顯著高于RI/S=1.5和RI/S=2.0處理組(P＜0.05)，且TS=6%、RI/S=3.0時(shí)累積甲烷產(chǎn)量最大，為507.31 mL/g. 這說明厭氧發(fā)酵系統(tǒng)需要有充足的接種物，微生物數(shù)量較大時(shí)，底物能夠充分地被利用并轉(zhuǎn)化為甲烷，因此在一定范圍內(nèi)，接種比越大其甲烷產(chǎn)量越高. 該結(jié)果與已有研究基本一致，如Rodriguez-Chiang等[23]采用接種比為0.8～2.0開展了微晶纖維素生產(chǎn)廢水的產(chǎn)甲烷潛力研究，發(fā)現(xiàn)在接種比為2.0時(shí)累積甲烷量最大；席江等[24]研究了接種比為2.0～8.0時(shí)榨汁橙渣的厭氧發(fā)酵情況，結(jié)果表明，當(dāng)接種比為8.0時(shí)，甲烷累積產(chǎn)率最大且發(fā)酵周期更短；

利用修正的Gompertz方程對累積甲烷產(chǎn)量進(jìn)行擬合，確定不同處理下甲烷產(chǎn)出過程的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，模擬發(fā)酵的動(dòng)態(tài)過程，判斷產(chǎn)氣滯留時(shí)間以及定量分析發(fā)酵底物的產(chǎn)甲烷潛力. 12個(gè)處理下菜籽餅厭氧發(fā)酵的累積甲烷產(chǎn)量曲線與修正的Gompertz方程擬合曲線見圖3，擬合得到的最終甲烷潛力(Pm)、產(chǎn)氣滯留時(shí)間(λ)和決定系數(shù)(R2)等關(guān)鍵參數(shù)如表3所示. 由表3可見，各處理的R2均在0.99以上，能較好地反映菜籽餅厭氧發(fā)酵的產(chǎn)甲烷規(guī)律. 含固率一定時(shí)，接種比越大，λ越小. 例如，在TS=6%條件下，RI/S分別為3.0、2.0、1.5時(shí)的λ依次為0.67、4.31、12.14 d.RI/S=3.0時(shí)的λ為0.67～2.82 d，RI/S=2.0時(shí)的λ為4.31～6.09 d，RI/S=1.5時(shí)的λ為6.18～17.73 d，說明較大的接種比發(fā)酵時(shí)系統(tǒng)的負(fù)荷較低，反應(yīng)更容易進(jìn)行，且接種比較小的情況不適合高含固率菜籽餅發(fā)酵.RI/S=3.0時(shí)各處理擬合得到的Pm和累積甲烷產(chǎn)量(P)較為接近，其中，TS=6%時(shí)獲得該處理組的最大值，為568.43 mL/g. 其余接種比各處理下Pm與P相差較大，說明這些處理發(fā)酵系統(tǒng)負(fù)荷較大，影響了累積甲烷產(chǎn)量.

圖3 累積甲烷產(chǎn)量及擬合曲線Fig.3 Cumulative methane production and fitting curve

表3 各處理組采用修正的Gompertz模型擬合得出的產(chǎn)甲烷參數(shù)Table 3 Modified Gompertz model parameters for each treatment group

該研究結(jié)果表明，當(dāng)RI/S=3.0、TS=6%時(shí)，菜籽餅厭氧發(fā)酵獲得了最大累積甲烷產(chǎn)量，為507.31 mL/g，且動(dòng)力學(xué)模型擬合得到了較高的甲烷潛力，為568.43 mL/g. 將該結(jié)果與其他原料相比：未經(jīng)過氣爆處理的廢棄煙草葉的最大累積甲烷產(chǎn)量為252.7 mL/g[26]；不同預(yù)處理后蘆葦?shù)淖畲罄鄯e甲烷產(chǎn)量為238 mL/g[27]；經(jīng)預(yù)處理后的麥糠最大累積甲烷產(chǎn)量為199.5 mL/g[28]；餐廚垃圾在CSTR反應(yīng)器55 ℃高溫時(shí)的最大累積甲烷產(chǎn)量為463 mL/g[29]；餐廚垃圾與污泥、秸稈不同配比聯(lián)合中溫厭氧發(fā)酵的最好配比下的累積甲烷產(chǎn)量為373 mL/g[30]；添加了纖維素酶和α-淀粉酶的豬糞獲得的最大累積甲烷產(chǎn)量為392.1 mL/g[31]. 由此可知，相比于秸稈、餐廚垃圾和糞便等原料，菜籽餅具有更高的產(chǎn)甲烷潛力，將其作為厭氧消化原料具有更加明顯的優(yōu)勢.

2.3 含固率和接種比對厭氧發(fā)酵液特性的影響

該試驗(yàn)27 d發(fā)酵過程中VFAs、堿度、氨氮濃度及pH的變化見圖4～7. VFAs是有機(jī)質(zhì)經(jīng)過水解和酸化形成的主要產(chǎn)物，是影響厭氧消化的主要因素之一[32-33]. 當(dāng)厭氧發(fā)酵酸化階段產(chǎn)生的VFAs濃度超過4 500 mg/L時(shí)，產(chǎn)甲烷過程受到抑制[34]. 堿度是判斷厭氧發(fā)酵系統(tǒng)緩沖能力的重要指標(biāo)[35-36]. VFAs濃度與堿度的比值可以反映厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定性，比值高于0.8時(shí)，厭氧消化過程會受到抑制[37]. 由圖4、5可見，各處理的VFAs濃度呈先升后降的趨勢，同接種比下，含固率越高，VFAs濃度峰值就越大；除了TS=8%處理組的VFAs濃度在第7天出現(xiàn)峰值外，其余處理組均在第4天出現(xiàn)峰值，因?yàn)樵诟吆搪实那闆r下，中間傳質(zhì)效率會降低，從而導(dǎo)致VFAs累積；堿度呈逐漸上升趨勢，且接種比一定時(shí)，含固率越高，堿度越大. 同時(shí)，在整個(gè)厭氧發(fā)酵過程中各處理組的VFAs濃度與堿度的比值均小于0.8，說明各處理組厭氧發(fā)酵系統(tǒng)均較為穩(wěn)定.

圖4 各處理組VFAs濃度的變化Fig.4 Change of the concentration of VFAs in each treatment group

氨氮是厭氧微生物生長必要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，當(dāng)氨氮濃度高于1 500 mg/L時(shí)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)可能會受到影響，并且隨著氨氮濃度的升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)[38]. 由圖6可見，各處理組的氨氮濃度均呈先升高后降低再趨于平緩的趨勢，且均在第10天出現(xiàn)峰值.同時(shí)，整個(gè)發(fā)酵階段所有處理的氨氮濃度均未超過1 200 mg/L，說明各處理組全程均未出現(xiàn)氨抑制.

圖5 各處理組堿度的變化Fig.5 Change of alkalinity concentration in each treatment group

圖6 各處理組氨氮濃度的變化Fig.6 Change of ammonia nitrogen concentration in each treatment group

pH是影響厭氧消化進(jìn)程的主要因素之一. 產(chǎn)甲烷菌在pH為6.0～8.0時(shí)均可生長，其產(chǎn)氣的最佳pH為6.5～7.5[39]；pH過高或過低均可能抑制產(chǎn)甲烷菌的活性[40]. 由圖7可見，整個(gè)發(fā)酵階段各處理組的pH在6.5～8.0之間變化，屬于產(chǎn)甲烷菌的正常范圍.RI/S=1.5和RI/S=2.0時(shí)，各處理組的pH均呈先降低后升高的趨勢，且均在第4天時(shí)pH最低，符合多數(shù)厭氧消化體系pH的變化規(guī)律. 這是因?yàn)?，厭氧消化初期菜籽餅占比較大，其水解酸化造成VFAs過度積累，導(dǎo)致pH降低；之后隨著產(chǎn)甲烷菌活性的恢復(fù)，積累的VFAs被逐漸消耗，pH逐漸上升[39]；pH在后期穩(wěn)定在7.4～7.8左右(除TS=8%、RI/S=1.5處理外，因在接種比低而含固率過高的條件下會出現(xiàn)整個(gè)發(fā)酵體系VFAs始終累積的現(xiàn)象). 相比于RI/S=1.5和RI/S=2.0，RI/S=3.0時(shí)各處理的pH呈升高-降低-回升-趨于平緩的趨勢，均在第10天時(shí)pH最低. 在較高接種比的發(fā)酵系統(tǒng)中，微生物相應(yīng)較多，菜籽餅水解產(chǎn)生的VFAs能迅速被微生物吸收，不會導(dǎo)致酸化；且該時(shí)期含氮大分子逐漸分解，產(chǎn)生氨氮物質(zhì)，也能使pH上升[41].

圖7 各處理組pH的變化Fig.7 Change of pH value in each treatment group

3 結(jié)論

a) 不同含固率和接種比均對菜籽餅中溫厭氧消化的發(fā)酵啟動(dòng)時(shí)間和累積甲烷產(chǎn)量產(chǎn)生影響，且接種比的影響大于含固率.

b) 在試驗(yàn)研究參數(shù)范圍內(nèi)，接種比越大，發(fā)酵啟動(dòng)越快；接種比一定時(shí)，累積甲烷產(chǎn)量隨含固率的增加呈先升高后降低的趨勢；在高含固率條件下，累積甲烷產(chǎn)量隨接種比的增加而增加. 當(dāng)RI/S=3.0、TS=6%時(shí)累積甲烷產(chǎn)量最大，為507.31 mL/g. 含固率一定時(shí)，接種比越大，產(chǎn)氣滯留時(shí)間(λ)越短. 結(jié)果顯示，菜籽餅作為厭氧消化原料的潛力較為明顯.

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