馬嬌陽，保欣晨，張振寧，王成塵，崔道雷，向 萍

西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院/環(huán)境修復(fù)與健康研究院, 云南 昆明 650224

鎘(Cadmium，Cd)是一種普遍存在于環(huán)境中的污染物，且具有較強(qiáng)的生物毒性[1]. 隨著工業(yè)的生產(chǎn)與發(fā)展，土壤和水體中的Cd污染日益嚴(yán)重[2-3]，水稻、蔬菜等植物源性食物可以通過根系富集土壤中的Cd，水體中的Cd也可通過食物鏈逐漸富集到魚蝦貝類等海產(chǎn)品中造成食品污染[4-6]. 因此，長期攝入被Cd污染的食品可導(dǎo)致其在體內(nèi)蓄積，從而對人體產(chǎn)生危害. 肝臟作為機(jī)體的主要代謝場所，且是人體急性或慢性Cd中毒的主要靶器官，對金屬的毒性敏感性較強(qiáng)，這可能是由于肝臟中可合成金屬硫蛋白，從而減弱Cd對人機(jī)體的危害[7-9]. 然而，當(dāng)肝細(xì)胞持續(xù)壞死或凋亡時，將會影響Cd金屬硫蛋白復(fù)合物的表達(dá)[10].研究表明，低濃度Cd (0.25 μmol/L)可能會促進(jìn)細(xì)胞的增殖[11]，而高濃度Cd (＞5 μmol/L)會誘導(dǎo)許多器官和組織的凋亡[12].

重金屬對肝臟具有明顯的毒性效應(yīng)，在細(xì)胞水平上重金屬可影響細(xì)胞的活性、分化和凋亡等[13]. 目前，人正常肝細(xì)胞系(HL-7702)和肝癌細(xì)胞系(HepG2)均被用于重金屬毒性研究[10,14-17]，且人正常肝細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系對重金屬的響應(yīng)不同. 目前，研究者多采用肝癌細(xì)胞系(HepG2)來探究Cd對人體肝細(xì)胞的毒性效應(yīng)及其機(jī)制[18-19]，但人正常細(xì)胞系和癌細(xì)胞系中的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平具有明顯差異，因此兩種不同類型的細(xì)胞可能對重金屬毒性的耐受性有所差異[20].Xiang等[21]研究表明，采用人正常肝細(xì)胞可準(zhǔn)確評估外部污染物對肝臟的毒性效應(yīng)，與肝癌細(xì)胞相比，正常肝細(xì)胞與人體內(nèi)組織的生理生化條件更加吻合.

目前，Cd對人正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的毒性效應(yīng)及其分子機(jī)制的研究較為鮮見. 因此，該研究對正常肝細(xì)胞系(HL-7702)和肝癌細(xì)胞系(HepG2)經(jīng)Cd暴露后在細(xì)胞活力、形態(tài)、凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)等方面的響應(yīng)差異進(jìn)行了深入研究，比較了Cd對兩種細(xì)胞的毒性效應(yīng)，以期為準(zhǔn)確評價Cd對肝細(xì)胞的毒性效應(yīng)提供科學(xué)的試驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 設(shè)備及試劑

該研究使用的設(shè)備有以下幾種：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(371型，賽默飛，美國)；酶標(biāo)儀(SpectraMax?Plus 384型，Molecular Devices LLC公司，美國)；倒置顯微鏡(TS-10型，尼康，日本)；流式細(xì)胞儀(CyFlow?Cube6型，Sysmex Partec GmbH，德國)；高速冷凍離心機(jī)(ST16R型，Thermo，美國)；超微量分光光度計(Nanophotometer N60型，IMPLEN，德國)；梯度PCR儀(Mastercycler Nexus Gradient型，Eppendorf，德國)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(熒光定量)( LightCycler?480 Ⅱ型，瑞士羅氏).

該研究使用的試劑有以下幾種：DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基、MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素鏈霉素溶液-雙抗(penicillin streptomycin，PS)和0.25%胰蛋白酶溶液，均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；CCK-8法細(xì)胞增殖檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、總RNA快速提取試劑、cDNA第一鏈快速合成試劑盒(去基因組)、SYBR green qPCR master mix，均購自南京翼飛雪生物科技有限公司；分析純氯化鎘(CdCl2)，購自上海金山亭新化工試劑廠.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與暴露

人正常肝細(xì)胞系(HL-7702)來自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)，人肝癌細(xì)胞系(HepG2)來自美國模式培養(yǎng)物寄存庫(American type culture collection，ATCC).HL-7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞分別生長于含有10%胎牛血清、1%PS的DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基和MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

用純水溶解CdCl2以配置細(xì)胞暴露母液，并用0.22 μm濾膜(Milipore-GP，美國)除菌以備用. 在進(jìn)行細(xì)胞暴露前，利用細(xì)胞相應(yīng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基將CdCl2溶液稀釋至目標(biāo)濃度.

1.3 細(xì)胞形態(tài)及活力

為探究重金屬Cd對正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞活力的變化，將HL-7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞以1×104cells/(100 μL·孔)的密度接種于96孔板中，并于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜待細(xì)胞貼壁. 根據(jù)Aziz等[10]所設(shè)定的Cd濃度對細(xì)胞進(jìn)行暴露，將完全培養(yǎng)基更換為含有不同Cd濃度(0～4 mg/L)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h. Cd暴露后，利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)并拍照，隨后根據(jù)CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行吸光度測定.

1.4 細(xì)胞凋亡

為測定細(xì)胞凋亡，將HL-7702和HepG2細(xì)胞以1×106cells/(2 mL·孔)的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，將完全培養(yǎng)基吸出并棄掉，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組，以含0.25和1 mg/L Cd的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為試驗暴露組. 隨后，將細(xì)胞放置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞并用預(yù)冷的PBS溶液洗滌2次，用1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中依次加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)孵育細(xì)胞. 最后，用流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況并用FlowJo v10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

1.5 RNA提取、轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR

為了探究重金屬Cd對肝細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制，進(jìn)一步測定其相關(guān)基因的表達(dá). 在HL-7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞暴露于0.25和1 mg/L Cd溶液24 h后，進(jìn)行總RNA快速提取，并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA. 之后，利用SYBR green qPCR master mix進(jìn)行實時定量PCR (qRT-PCR)，反應(yīng)循環(huán)條件：首先為95 ℃ 10 min；然后在95℃ 15 s和60℃ 1 min的條件下循環(huán)40次.以β-Actin作為內(nèi)參基因來計算相關(guān)基因的表達(dá)，細(xì)胞凋亡相關(guān)的引物序列如表1所示.

表1 細(xì)胞凋亡相關(guān)引物信息Table 1 The information of apoptosis related primers

1.6 數(shù)據(jù)分析

研究數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)，利用Microsoft Office Excel 2019軟件計算數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 8和FlowJo v10軟件作圖，認(rèn)為當(dāng)P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 重金屬鎘對肝細(xì)胞活力及形態(tài)影響

細(xì)胞活力是反映污染物對細(xì)胞毒性效應(yīng)的重要指標(biāo)之一. 為探究Cd對正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞活力的差異，該研究將HL-7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞暴露于不同濃度的Cd中以測定細(xì)胞活力的變化，結(jié)果表明，正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的細(xì)胞活力變化趨勢有所差異. 由圖1(a)(c)可見：當(dāng)Cd濃度為0.25和0.5 mg/L時，正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞活力下降均小于5%，且與對照組無顯著差異；當(dāng)Cd濃度為1 mg/L時，HL-7702細(xì)胞活力降至65% (P＜0.000 1)，而HepG2細(xì)胞活力與對照組無顯著差異；當(dāng)Cd濃度大于1 mg/L時，兩種細(xì)胞活力均明顯下降. 結(jié)果說明，Cd所誘導(dǎo)的肝細(xì)胞毒性是具有濃度依賴性的，與Aziz等[10]研究結(jié)果較為一致. 基于擬合曲線，兩種細(xì)胞對Cd的半致死濃度(LC50)如圖1(b)(d)所示，HL-7702細(xì)胞對Cd的半數(shù)致死濃度(LC50)(1.9 mg/L)低于HepG2細(xì)胞(2.4 mg/L)，說明兩種細(xì)胞對Cd暴露的耐受性不同，正常肝細(xì)胞對Cd更為敏感，與Xiang等[21]研究結(jié)果相似，其發(fā)現(xiàn)細(xì)胞暴露于外部污染物后肝癌細(xì)胞比正常肝細(xì)胞更具有耐受性. 此外，正常肺細(xì)胞(MRC-9)和癌變肺細(xì)胞(A549)對Cd暴露的敏感性也有所不同[22]. 因此，正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞對Cd暴露的毒性響應(yīng)具有差異.

圖1 不同濃度Cd對正常肝細(xì)胞（HL-7702）和肝癌細(xì)胞（HepG2）活力及半數(shù)致死濃度（LC50）的影響Fig.1 Effects of cadmium exposure on cell viability and the lethal concentration (LC50) of normal (HL-7702) and cancerous (HepG2) hepatic cells

利用倒置顯微鏡觀察不同Cd濃度暴露組下HL-7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的形態(tài)差異. 由圖2可見：對照組中，HL-7702細(xì)胞形態(tài)呈多邊形狀；當(dāng)暴露于0.25 mg/L的Cd后細(xì)胞形態(tài)與對照組差異不明顯；而當(dāng)HL-7702細(xì)胞暴露于1 mg/L的Cd后，有部分細(xì)胞萎縮成圓形并具有明顯的細(xì)胞碎片堆積，且該濃度Cd暴露下，細(xì)胞活力也顯著下降〔見圖1(a)〕，說明Cd使正常肝細(xì)胞產(chǎn)生明顯損傷[23]. 對照組中，HepG2細(xì)胞呈堆積生長，單個細(xì)胞形態(tài)不明顯；當(dāng)暴露于0.25和1 mg/L的Cd后，均與對照組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，同樣HepG2細(xì)胞活力也無顯著下降趨勢〔見圖1(c)〕.

圖2 不同濃度Cd暴露后正常肝細(xì)胞（HL-7702）和肝癌細(xì)胞（HepG2）的形態(tài)變化Fig.2 Morphology changes of normal (HL-7702) and cancerous (HepG2) hepatic cells after exposure to cadmium

2.2 重金屬Cd誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是一種嚴(yán)格控制的程序性細(xì)胞死亡過程，其對生物體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及系統(tǒng)的生長發(fā)育有重要作用，但異常凋亡是一種病理過程[24-26]. 根據(jù)細(xì)胞活力及形態(tài)的結(jié)果，將HL-7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞暴露于濃度為0.25和1 mg/L的Cd中，研究Cd誘導(dǎo)兩種肝細(xì)胞凋亡情況的差異. Annexin V-FITC和PI雙染法常被應(yīng)用于區(qū)分細(xì)胞早期凋亡與晚期凋亡[27]，因此對細(xì)胞進(jìn)行雙染后，利用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的分布(見圖3)，其中象限Q1～Q4分別代表壞死、晚期凋亡、早期凋亡、活細(xì)胞的數(shù)量. 由圖3可見：暴露在濃度為0.25 mg/L的Cd下，HL-7702細(xì)胞凋亡率與對照組無顯著差異；而Cd濃度升至1 mg/L時，正常肝細(xì)胞凋亡率顯著升高，較對照組凋亡率增加了4倍. 因此，暴露于不同濃度的Cd后人正常肝細(xì)胞凋亡率變化規(guī)律與其對應(yīng)的細(xì)胞活力一致，而Cd對HepG2細(xì)胞凋亡的影響與HL-7702細(xì)胞不同，暴露于0.25和1 mg/L的Cd后，HepG2細(xì)胞的凋亡率均增至對照組的2倍〔見圖3(e)～(h)〕. 因此，在該研究檢測濃度(0.25～1 mg/L)下，正常肝細(xì)胞的抗凋亡能力顯著高于肝癌細(xì)胞，可能與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞中有超過500個表達(dá)異常的基因，細(xì)胞表面死亡受體差異較大，多個輔助細(xì)胞抵抗外界刺激的酶活性均顯著降低[20,28-29]. 因此，采用HepG2細(xì)胞探究Cd對人體肝臟細(xì)胞凋亡的影響將會高估其健康風(fēng)險. 此外，細(xì)胞死亡可通過壞死或凋亡發(fā)生[16]. 該研究中暴露于Cd后，與對照組相比，正常肝細(xì)胞活細(xì)胞率從97.3%降至85.3%，降幅為12%〔見圖3(a)～(c)〕，而肝癌細(xì)胞的降幅為5.3%〔見圖3(e)～(g)〕. 因此，暴露于0.25～1 mg/L Cd中HL-7702細(xì)胞的活細(xì)胞率降幅明顯高于HepG2細(xì)胞，與細(xì)胞活力檢測呈現(xiàn)的趨勢較為一致.綜上，不同濃度Cd均能促進(jìn)兩種細(xì)胞的凋亡率或壞死率，從而降低活細(xì)胞的比率.

圖3 Cd誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞（HL-7702）和肝癌細(xì)胞（HepG2）凋亡情況Fig.3 Cadmium triggered human normal (HL-7702) and cancerous (HepG2) hepatic cell apoptosis

細(xì)胞凋亡在Cd所誘導(dǎo)的肝毒性中是一個極其重要的過程[30]，而目前研究Cd對肝細(xì)胞的損傷多采用肝癌細(xì)胞(HepG2). 然而，正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的代謝具有差異，因此可能會影響其對外部脅迫的響應(yīng). Wang等[31]研究表明，相同濃度藥物作用下HepG2細(xì)胞的凋亡率明顯增加，而HL-7702細(xì)胞并無顯著變化. 此外，在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞暴露于高劑量金屬有機(jī)骨架化合物后，HL-7702細(xì)胞凋亡率較HepG2細(xì)胞更明顯[32]. 因此，在外部脅迫下正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞毒性響應(yīng)存在差異. 在其他生物體內(nèi)，重金屬Cd也可引起肝臟凋亡的現(xiàn)象. Habeebu等[30]研究表明，Cd暴露組的小鼠肝臟凋亡指數(shù)增至對照組的30倍. 此外，Cd也可誘導(dǎo)斑馬魚ZFL肝臟細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的現(xiàn)象[33]. 因此，當(dāng)生物體內(nèi)攝入Cd后會在肝臟積累，從而可能對組織器官產(chǎn)生毒性效應(yīng).

2.3 重金屬鎘改變肝細(xì)胞凋亡相關(guān)基因

為了進(jìn)一步闡述Cd誘導(dǎo)不同肝細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制的差異，利用qRT-PCR技術(shù)測定與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平.Bcl-2和Bax屬于Bcl-2基因家族，其中，Bcl-2是一種原癌基因，可抑制細(xì)胞的凋亡，其可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)；而Bax是促凋亡基因，其表達(dá)過高將會加速細(xì)胞死亡[34-36]. 兩種細(xì)胞在暴露于不同濃度的Cd后，有關(guān)凋亡基因的mRNA表達(dá)水平如圖4所示. 由圖4可見：暴露于1 mg/L的Cd可明顯下調(diào)HL-7702細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平，但可上調(diào)HepG2細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平；而兩種細(xì)胞在暴露于0.25和1 mg/L的Cd后，Bax的表達(dá)均無顯著性變化. 此外，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生也可通過Bcl-2/Bax(表達(dá)水平的比值)的降低進(jìn)行表征[37]，暴露于1 mg/L的Cd可顯著降低HL-7702細(xì)胞中Bcl-2/Bax值(降至0.54±0.14)，而Cd對HepG2細(xì)胞中Bcl-2/Bax值無顯著影響. 因此，Cd暴露僅誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞中Bcl-2家族相關(guān)基因的表達(dá)，而對肝癌細(xì)胞無顯著影響.Caspase-3作為效應(yīng)凋亡蛋白酶，在線粒體凋亡途徑中起至關(guān)重要的作用，其過量表達(dá)將會介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[38-39]. HL-7702細(xì)胞暴露于1 mg/L的Cd后，Caspase-3的表達(dá)上調(diào)至對照組的2倍〔見圖4(a)〕，然而在HepG2細(xì)胞中兩種不同濃度的Cd均明顯誘導(dǎo)Caspase-3表達(dá)上調(diào)〔見圖4(b)〕，該結(jié)果與流式細(xì)胞儀所測細(xì)胞凋亡率的結(jié)果較為一致. 綜上，Cd可激活細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路，進(jìn)而使正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡.

圖4 暴露于不同濃度Cd后正常肝細(xì)胞（HL-7702）和肝癌細(xì)胞（HepG2）凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平Fig.4 Cell apoptosis related genes expression in both normal (HL-7702) and cancerous (HepG2)hepatic cells after exposure to cadmium

研究[40]表明，重金屬Cd會引起生物體組織/器官凋亡相關(guān)基因表達(dá)的改變，其中在U-87 MG人星形膠質(zhì)細(xì)胞中，當(dāng)Cd濃度大于2.2 mg/L時，會誘導(dǎo)下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá). 同樣，Cd也可降低人支氣管細(xì)胞16-HBE中Bcl-2的表達(dá)[41]. 對于人或水生生物肝細(xì)胞，Cd可通過激活Caspase-3等相關(guān)信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[42-43]. 筆者研究中正常肝細(xì)胞暴露于Cd后，不僅激活了Caspase-3的表達(dá)，而且降低了Bcl-2表達(dá)；但在肝癌細(xì)胞，Cd僅誘導(dǎo)上調(diào)Caspase-3的表達(dá). 結(jié)果表明，Cd可通過激活正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致凋亡. 因此，正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞將通過不同的分子機(jī)制來響應(yīng)Cd暴露對細(xì)胞產(chǎn)生的毒性效應(yīng).

3 結(jié)論

a) 不同濃度的Cd對正常肝細(xì)胞(HL-7702)和肝癌細(xì)胞(HepG2)活力的影響存在差異，HL-7702細(xì)胞對Cd的半數(shù)致死濃度(LC50)為1.9 mg/L，HepG2細(xì)胞為2.4 mg/L，正常肝細(xì)胞對Cd毒性更為敏感.

b) 當(dāng)Cd濃度為0.25 mg/L時，僅誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡；而Cd達(dá)1 mg/L時，HL-7702和HepG2細(xì)胞的凋亡率均明顯升高. 因此，在Cd暴露后，正常肝細(xì)胞抗凋亡能力要顯著高于肝癌細(xì)胞，而利用肝癌細(xì)胞將會高估Cd對人體肝臟的健康風(fēng)險.

c) 在HL-7702細(xì)胞中，Cd通過激活Caspase-3和降低Bcl-2的表達(dá)使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡；在HepG2細(xì)胞中，Cd僅激活Caspase-3的表達(dá). 綜上，Cd可通過改變不同凋亡基因的表達(dá)促使正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞凋亡.