李艷麗，李曉燁，陳 燦，潘 雯，李曉宇，呂遷洲

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥劑科，上海 200032)

急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)是冠心病的一種嚴(yán)重類型，通常由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂、血流減少、血栓形成導(dǎo)致[1]。根據(jù)指南推薦[2-3]，阿司匹林和氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板治療可以預(yù)防ACS患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)支架植入后的主要心血管不良事件(MACE)。然而，有研究報(bào)道有5%～15%的ACS患者出現(xiàn)心肌梗死、腦卒中甚至死亡等臨床終點(diǎn)事件，這主要是由于個(gè)體對(duì)氯吡格雷反應(yīng)的差異性造成的[4]。氯吡格雷是一種無(wú)活性的前體藥物，通過(guò)腸道吸收，在體內(nèi)需要依賴肝臟細(xì)胞色素P450(CYP450)酶催化轉(zhuǎn)化成活性代謝產(chǎn)物，再與血小板表面腺苷酸環(huán)化酶偶聯(lián)的腺苷二磷酸(ADP)受體P2Y12結(jié)合，選擇性地抑制血小板聚集[5]。其中，CYP450酶系統(tǒng)中的CYP2C19是影響氯吡格雷療效的主要基因。有研究表明，CYP2C19等位基因(*2/*2、*2/*3、*3/*3)功能降低可能與支架內(nèi)血栓形成和MACE的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[6-7]，其導(dǎo)致的氯吡格雷代謝減慢也被證明可以降低ACS患者服用負(fù)荷劑量氯吡格雷的抗血小板活性[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，外排泵P-糖蛋白(P-gp)通過(guò)ABCB1編碼的細(xì)胞外膜和細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)藥物，可能通過(guò)影響吸收而導(dǎo)致氯吡格雷反應(yīng)的變異性[9]。此外，編碼基因中的對(duì)氧磷酶1(PON1)參與了氯吡格雷活化過(guò)程中的水解反應(yīng)，因此其基因多態(tài)性也影響氯吡格雷生物活化[10]。本研究旨在探討ACS患者氯吡格雷相關(guān)代謝基因多態(tài)性與其臨床抗血小板作用和MACE的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)明確診斷為ACS的患者，包括急性ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死和不穩(wěn)定性心絞痛；(2)年齡大于或等于18歲；(3)接受阿司匹林和氯吡格雷雙重抗血小板治療；(4)胸痛大于或等于10 min，心電圖ST段和T波改變，心臟生物標(biāo)志物升高。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)對(duì)阿司匹林或氯吡格雷過(guò)敏或有禁忌的患者；(2)年齡小于18歲或未簽署知情同意書(shū)；(3)出血和出血性疾病病史；(4)伴有嚴(yán)重肝或腎功能不全；(5)同時(shí)使用西洛他唑或加糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑。

1.1.2一般資料 收集2019年1-12月在本院心臟重癥監(jiān)護(hù)室就診的170例診斷為ACS的患者臨床資料。所有患者均表現(xiàn)為胸痛、不適、氣短、頭暈、惡心、出汗等癥狀，并伴隨心臟生物標(biāo)志物肌鈣蛋白、肌酸激酶水平升高和心電圖T波、ST段改變。所有患者均行PCI手術(shù)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均簽署了書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1治療方法 所有患者行PCI術(shù)前均給予負(fù)荷劑量的氯吡格雷(300 mg)和阿司匹林(300 mg)，然后維持75 mg/d的氯吡格雷聯(lián)合100 mg/d的阿司匹林抗血小板治療。所有患者入院時(shí)同時(shí)服用低分子肝素、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素受體拮抗劑(ARB)、他汀類、β受體阻滯劑、質(zhì)子泵抑制劑(PPI)和硝酸酯類等藥物。

1.2.2基因檢測(cè) 患者入院后采集大約2 mL的全血樣本，置于含有抗凝劑乙二胺四乙酸(EDTA)的真空采集器中，用于氯吡格雷基因檢測(cè)。采用QIAamp 血液DNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)分離每例患者的DNA，基于Sequence Mass Array平臺(tái)進(jìn)行基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè)。CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1和PON1 Q192R LOF基因分別為681G>A(rs4244285)、636G>A(rs4986893)、3435C>T(rs1045642)和575A>G(rs662)的點(diǎn)突變。根據(jù)不同基因型所編碼的酶對(duì)氯吡格雷的不同藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征將野生基因型(*1/*1)歸為快代謝型(EM)，將突變雜合基因型(*1/*2、*1/*3)歸為中間代謝型(IM)，將突變純合基因型(*2/*2、*2/*3、*3/*3)歸為慢代謝型(PM)[11]。

1.2.3血小板聚集抑制率測(cè)定 負(fù)荷劑量氯吡格雷給藥5 d后，采集大約4 mL的全血樣本，通過(guò)血栓彈力圖分析儀(TEG，美國(guó)Heomescope公司)測(cè)定血小板聚集抑制率(IPA)，采用計(jì)算機(jī)記錄振幅的變化。凝血強(qiáng)度振幅的最大變化被定義為最大凝血強(qiáng)度(MA)。根據(jù)加入血樣誘導(dǎo)劑的不同，MA可分為凝血酶誘導(dǎo)的最大凝血強(qiáng)度(MAThrombin)、20 μmol/L ADP誘導(dǎo)的最大凝血強(qiáng)度(MAADP)和纖維蛋白原誘導(dǎo)的最大凝血強(qiáng)度(MAFibrin)。ADP誘導(dǎo)的IPA(%)=(MAADP-MAFibrin)/(MAThrombin-MAFibrin)×100%，其中IPA<30%為氯吡格雷治療后血小板高反應(yīng)性(HPR)組，IPA≥30%為氯吡格雷治療后血小板低反應(yīng)性(LPR)組[12]。同時(shí)將花生四烯酸(AA)誘導(dǎo)的IPA<50%定義為阿司匹林抵抗。

1.2.4隨訪與臨床終點(diǎn)事件 所有納入患者于PCI術(shù)后12個(gè)月內(nèi)進(jìn)行定期門(mén)診和電話隨訪。主要觀察隨訪患者M(jìn)ACE的發(fā)生率，包括心源性死亡、心血管死亡率、心肌梗死、缺血性腦卒中和病變血管的血運(yùn)重建。

2 結(jié) 果

2.1患者的基本特征 在所有納入的患者中，有21例患者失訪，最終研究的樣本量為149例，其中男118例(79.19%)，女31例(20.81%)；年齡31～90歲，平均(65.29±11.23)歲。在PCI術(shù)后12個(gè)月的隨訪中，21例(14.09%)患者再次入院接受血管重建術(shù)，3例(2.01%)患者發(fā)生缺血性腦卒中事件。見(jiàn)表1。

表1 納入ACS患者的臨床特征(n=149)

2.2患者的基因型分布和等位基因的頻率分布 本研究對(duì)與氯吡格雷臨床療效相關(guān)的4種基因型進(jìn)行了檢測(cè)，包括CYP2C19*2(rs4244285)、*3(rs4986893)、ABCB1 C3435T(rs1045642)和PON1 Q192R(rs662)。除PON1 Q192R(rs662)外，所有研究群體的遺傳變異均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 患者的基因型分布和等位基因的頻率分布(n=149)

2.3單因素分析預(yù)測(cè)HPR的風(fēng)險(xiǎn)因素 入選的149例患者中，HPR組23例(15.44%)，LPR組126例(84.56%)，HPR組與LPR組患者相比，AA誘導(dǎo)的IPA顯著降低(P<0.05)。在CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、PON1 Q192R LOF等位基因存在時(shí)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

2.4多因素logistic回歸分析預(yù)測(cè)HPR的風(fēng)險(xiǎn)因素 將單因素分析中，P<0.15的變量(性別、BMI、AA-IPA、合并ACEI或ARB、合并硝酸酯類、基因型CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、PON1 Q192R LOF)作為協(xié)變量，HPR為因變量進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。結(jié)果顯示，AA-IPA、CYP2C19*2、CYP2C19*3 LOF等位基因?yàn)榘l(fā)生HPR的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

表4 多因素logistic回歸分析預(yù)測(cè)HPR的風(fēng)險(xiǎn)因素

2.5多因素logistic回歸分析預(yù)測(cè)MACE的風(fēng)險(xiǎn)因素 在12個(gè)月的隨訪中，主要的MACE包括因血運(yùn)重建而再次住院和缺血性腦卒中事件，患者為24例(16.11%)。在多變量logistic回歸分析中，阿司匹林抵抗(AA-IPA<50%)和ADP-IPA<30%與MACE之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CYP2C19*2 LOF等位基因與PCI術(shù)后12個(gè)月內(nèi)MACE的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(OR=3.112，95%CI1.048～9.241，P=0.041)。見(jiàn)表5。

表5 多因素logistic回歸分析預(yù)測(cè)MACE的風(fēng)險(xiǎn)因素

3 討 論

目前，PCI術(shù)后的標(biāo)準(zhǔn)雙聯(lián)抗血小板(阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷)治療已成為ACS患者的主要治療方案，可減少心血管不良事件的發(fā)生率。研究發(fā)現(xiàn)，氯吡格雷的個(gè)體差異性對(duì)患者治療后的血小板反應(yīng)性具有重要意義。常規(guī)進(jìn)行氯吡格雷相關(guān)基因檢測(cè)對(duì)ACS患者的個(gè)體化治療方案具有一定的指導(dǎo)意義。本研究對(duì)149例行PCI術(shù)的ACS患者進(jìn)行了氯吡格雷基因型檢測(cè)，采用血栓彈力圖(TEG)檢測(cè)PCI術(shù)后患者的氯吡格雷治療后血小板反應(yīng)性。

氯吡格雷作為一種前體藥物，需要經(jīng)過(guò)細(xì)胞P450酶的兩步氧化反應(yīng)才能轉(zhuǎn)化為有活性的代謝產(chǎn)物而發(fā)揮作用，其中CYP2C19基因編碼的酶蛋白是氯吡格雷代謝的關(guān)鍵酶，CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗有密切關(guān)系[13]。研究表明，CYP2C19 LOF等位基因會(huì)導(dǎo)致ADP誘導(dǎo)的IPA降低，增加支架血栓的風(fēng)險(xiǎn)[14]。在本研究中，CYP2C19*2 LOF等位基因的發(fā)生率(36.91%)較高，但CYP2C19*3、ABCB-C3435T和PON1 Q192R LOF等位基因的發(fā)生率均與以往研究相似。另外，PON1 Q192R(rs662)LOF等位基因的發(fā)生(MAF為46.97%)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可能與研究人群的差異有關(guān)。

HPR的發(fā)生是遺傳因素、細(xì)胞因素和臨床因素等多因素共同作用的結(jié)果，其中遺傳因素——基因多態(tài)性起到了關(guān)鍵性作用。本研究將年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史及合并高血壓、高血脂和糖尿病在內(nèi)的心血管危險(xiǎn)因素作為ACS發(fā)生的相關(guān)危險(xiǎn)因素。在單因素分析中，AA-IPA、CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1 TT和PON1 Q192R LOF等位基因在兩組患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。將P<0.15的相關(guān)因素經(jīng)logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，CYP2C19*2和CYP2C19*3是HPR的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。

CYP2C19是催化氯吡格雷生物轉(zhuǎn)化不可缺少的藥物代謝酶。CYP2C19*2 和CYP2C19*3 LOF等位基因損害生物活性，降低氯吡格雷活性代謝物濃度，使氯吡格雷抗血小板作用減弱，從而導(dǎo)致不良心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加[15]。本研究結(jié)果顯示，CYP2C19*2和CYP2C19*3 LOF等位基因與ACS患者血小板反應(yīng)性增高有關(guān)(P<0.05)。PON1是影響血小板活化的另一個(gè)遺傳因素，在氯吡格雷的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著重要作用，陸文岐等[16]研究表明，中國(guó)人群PON1(rs662)A等位基因?yàn)镠PR的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示，HPR組患者的PON1 Q192R LOF等位基因發(fā)生率明顯高于LPR組患者(P<0.05)，未發(fā)現(xiàn)PON1基因多態(tài)性與HPR的相關(guān)性。此外，ABCB1的SNP改變會(huì)影響氯吡格雷在腸道內(nèi)的吸收代謝，可能是氯吡格雷低反應(yīng)性產(chǎn)生的原因之一。有研究報(bào)道，與CC型或CT型患者相比較，TT型患者氯吡格雷吸收減少，并與支架內(nèi)早期血栓形成明顯相關(guān)[9]。本研究中，HPR組患者的ABCB1 TT型等位基因發(fā)生率明顯高于LPR組(P<0.05)，兩組患者的CC型和CT型發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

阿司匹林作為經(jīng)典的抗血小板藥物，不僅可以通過(guò)抑制環(huán)氧合酶抑制血小板聚集，還在ADP誘導(dǎo)的血小板抑制中發(fā)揮一定的作用[17]。在本研究中，HPR組AA誘導(dǎo)的IPA明顯低于LPR組(P<0.05)。另外，阿司匹林抵抗患者心血管不良事件的發(fā)生率較高(54.17%)，這可能與阿司匹林抵抗導(dǎo)致環(huán)氧合酶依賴的血栓素A2形成的抑制不足有關(guān)[18]。因此，采取積極的雙聯(lián)抗血小板治療對(duì)預(yù)防PCI術(shù)后血栓栓塞事件有重要作用。

氯吡格雷的基因多態(tài)性與PCI術(shù)后MACE的發(fā)生密切相關(guān)，SUN等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19中間代謝和慢代謝患者發(fā)生MACE的風(fēng)險(xiǎn)是快代謝患者的2.664倍，這是由于氯吡格雷不能被CYP2C19 LOF等位基因生物轉(zhuǎn)化，不能有效抑制血小板的活性狀態(tài)，最終導(dǎo)致血栓形成。本研究分析了24例發(fā)生MACE患者的風(fēng)險(xiǎn)因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非LOF等位基因相比，CYP2C19*2 LOF等位基因與MACE發(fā)生率增加有關(guān)，表明CYP2C19*2 LOF等位基因與PCI術(shù)后MACE的發(fā)生相關(guān)。

本研究有一定的局限性：(1)研究的樣本量較少，需要進(jìn)行大規(guī)模的前瞻性、隨機(jī)和對(duì)照良好的試驗(yàn)來(lái)評(píng)估氯吡格雷多態(tài)性與抗血小板作用的相關(guān)性；(2)患者的隨訪時(shí)間較短，延長(zhǎng)隨訪時(shí)間可能對(duì)以后的研究提供更大的價(jià)值；(3)隨訪途徑需要優(yōu)化，電話隨訪可能不能充分顯示患者的預(yù)后情況，需要在今后的研究中采取更優(yōu)化的隨訪方案；(4)未觀察PCI術(shù)后出血事件的發(fā)生情況。