王瑀彤，趙林博，李娜，王穎，靳書剛，李喜旺，王少華★

（河北北方學院預防獸醫(yī)學重點實驗室，河北張家口 075131；2.承德市畜牧技術推廣站，河北承德 067400）

動物源細菌耐藥性問題已經(jīng)成為影響人類健康和食品安全的全球性問題， 動物源耐藥菌可以通過食物鏈感染人體或將耐藥基因轉至人體病原菌而引發(fā)疾病， 對人類健康構成潛在危害[1]。 大腸桿菌屬于人和動物體內的共生菌，奶牛生產(chǎn)過程與人類的生活密切相關。 由于在大腸桿菌病的治療過程中抗生素的使用不當，造成了大腸桿菌耐藥譜和耐藥水平的不斷增加[2]。牛糞污染的牛奶、 肉類和水等容易感染人類而造成耐藥菌在人類間流行。 隨著奶牛業(yè)規(guī)?；?、現(xiàn)代化程度的不斷提高，細菌耐藥性越來越強，耐藥譜越來越廣，給臨床治療帶來了極大困難，同時也加劇了畜牧業(yè)的經(jīng)濟損失[3]。

許多文章研究顯示牛源大腸桿菌耐藥越來越嚴重[4-6]。 因此筆者對張家口地區(qū)的犢牛腹瀉大腸桿菌進行了分離、鑒定，并同時進行了耐藥分析。 為本地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌的防制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

犢牛腹瀉病料來自張家口地區(qū)各大型牛場，低溫保存運至實驗室。

1.1.2 試驗試劑

尹紅美蘭固體培養(yǎng)基： LB 液體培養(yǎng)基：10克/升胰蛋白胨，5 克/升酵母粉，10 克/升NaCl；LB 固體培養(yǎng)基：10 克/升胰蛋白胨，5 克/升酵母粉，10 克/升NaCl ，1.2%～1.5%的瓊脂粉；藥敏片購自北京天壇生物制品股份有限公司。 DNA Marker， 細菌DNA 基因組提取試劑盒，2×Taq-Master Mix， 購自北京塞恩諾爾科技有限公司；質控菌株大腸桿菌ATCC25922 由河北北方學院預防獸醫(yī)學重點試驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離

取腸內容物用生理鹽水不同濃度稀釋后3000 轉/分鐘離心5 分鐘，取上清液分別接種于營養(yǎng)肉湯瓊脂（LB）培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)16小時，無菌挑取灰白色的圓形單菌落，劃線于伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基， 于37℃恒溫培養(yǎng)16～24 小時，挑取伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上生長均勻、典型的、 帶金屬光澤的單菌落液體LB 培養(yǎng)基中增殖。 最后接種于M-H 肉湯中進行純培養(yǎng)，待用。

1.2.2 細菌的菌落形態(tài)和生化鑒定

將1.2.1 中分離到的細菌，進行革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)，同時將細菌純培養(yǎng)物接種于微量生化反應管，具體操作按照說明書。

1.2.3 16SrRNA 基因序列分析

利用Primer5 軟件，根據(jù)GenBank 中已經(jīng)發(fā)表的大腸桿菌的保守基因16SrRNA 設計鑒定大腸桿菌的特異性引物， 上游引物為5'－CCATTGTAGCACGTGTGT－3'， 下游引物為5'－GGGAGCAAACAGGATTAG－3'。 增菌液后提細菌基因組為模版， 進行PCR 擴增。反應條件：94℃5 分鐘；94℃1 分鐘；55℃1 分鐘，72℃1 分鐘，30 循環(huán)；最后72℃10 分鐘， 取PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR 產(chǎn)物提交于TaKaRa 公司，完成測序。 測序結果通過NCBI 的BLAST 檢索系統(tǒng)進行序列相似性比較， 并結合菌體形態(tài)與理化特性進行細菌的最終鑒定。

1.2.4 細菌的藥敏鑒定

將細菌稀釋成1×108cfu/毫升，取0.1 毫升菌液均勻涂布于MH 培養(yǎng)基上，干燥后貼上藥敏紙片，37℃培養(yǎng)24 小時，觀察抑菌圈并測量抑菌直徑。 判定結果參照CLSI 制定的藥敏標準。

2 結果

2.1 細菌的分離培養(yǎng)結果(見圖1）

圖1 大腸桿菌分離培養(yǎng)結果

無菌采集犢牛腹瀉物， 培養(yǎng)后結果顯示在LB 培養(yǎng)基上長出灰白色的圓形菌落， 在尹紅美蘭培養(yǎng)基長出帶有綠色金屬光澤的圓形菌落，初步鑒定分離到E.coli。

2.2 分離菌株的生化鑒定結果

對分離純化后的菌株進行生化鑒定。 結果顯示：三鐵塘培養(yǎng)基底及斜面程黃色，H2S 陰性，山梨醇發(fā)酵陰性，纖維二糖發(fā)酵陰性，胰蛋白胨肉湯靛基質陰性，M.R.試驗陽性，V-P 試驗陰性，檸檬酸鹽陰性，賴氨酸陰性，鳥氨酸脫羧酶陽性，棉子糖發(fā)酵陽性。 符合大腸桿菌特性。

2.3PCR 鑒定瓊脂糖凝膠電泳結果(見圖2圖3）

圖2 圖1 部分細菌基因組提取電泳結果

圖3 圖1 部分分離菌株的16S rRNA PCR 擴增結果

表2 分離大腸桿菌耐藥率分析結果

被檢樣品分離到的細菌的PCR 結果顯示，分離到的細菌樣品均在480 bp 處出現(xiàn)了特異性片段，對PCR 擴增產(chǎn)物測序，與GenBank 中登陸的細菌基因組16S rRNA 測序序列進行同源性比對， 結果表明分離到的細菌菌株均為大腸桿菌。

2.4 藥敏試驗結果

分離的28 株大腸桿菌藥物敏感性檢測結果顯示，28 株細菌都有不同程度的耐藥，其中8重耐藥有1 株細菌，7 重耐藥有7 株。 其他分離菌都表現(xiàn)出了不同程度的耐藥性。 對分離的28株大腸桿菌耐藥率分析， 發(fā)現(xiàn)分離菌對頭孢曲松耐藥率達到了96.60%， 多西環(huán)素達到了82.80%， 氨芐西林和氯霉素耐藥率達到了75.90%。 表明張家口地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌多重耐藥性嚴重。8 種抗生素的耐藥率都在58%以上。 不推薦在臨床上繼續(xù)使用。

3 討論

2019 年春節(jié)前后， 實驗室陸續(xù)收到犢牛腹瀉相關病例病原的診斷請求。 經(jīng)實驗室診斷發(fā)現(xiàn)以大腸桿菌為主要病原。 我們隨后對張家口地區(qū)相關牛場進行了走訪調查， 發(fā)現(xiàn)犢牛腹瀉普遍存在。 針對張家口地區(qū)犢牛腹瀉病的現(xiàn)狀，本研究采集了張家口部分牛場的犢牛腹瀉病料，共分離出28 株大腸桿菌。 隨后對其進行了藥敏試驗，結果發(fā)現(xiàn)分離菌對氨芐西林、頭孢曲松、多西環(huán)素、卡那霉素、諾氟沙星、四環(huán)素、氯霉素、 多粘菌素B 等8 種藥物， 耐藥率超過了58%。其中有一株菌對以上8 種藥物100%耐藥，有7 株分離菌對7 種藥產(chǎn)生耐藥，7 重耐藥菌株占到了總分離菌的25%。2 種以上耐藥菌株占比高達85.7%。 以上結果提示28 種分離菌出現(xiàn)了嚴重耐藥。 武瑞兵[7]從內蒙古地區(qū)分離了117 株牛肉源大腸桿菌進行了相關耐藥基因的PCR 技術鑒定，結果顯示117 株大腸桿菌對四環(huán)素、氨芐西林、鏈霉素和磺胺異惡唑的耐藥率較高，分別為89%、42%、38%、和22%。 表明了此次分離的牛肉源大腸桿菌耐藥非常嚴重。張陸在哈爾濱周邊地區(qū)分離鑒定出了26 株致病性大腸桿菌，檢測結果該地區(qū)主要流向致病性血清型O26、O78、O15， 所有致病性菌株都存在多重耐藥現(xiàn)象，其中阿莫西林-棒酸、鏈霉素、 四環(huán)素、 復方新諾明的耐藥率達到了100%[8]。 吳同壘等在2017～2018 年秦皇島地區(qū)犢牛源腹瀉大腸桿菌耐藥性分析的研究中發(fā)現(xiàn)對林可霉素高度耐藥， 耐藥率為100%； 對慶大霉素和阿米卡星的耐藥率為83.3%[9]。 張志強等在2020 年對河北省犢牛腹瀉大腸桿菌耐藥性研究發(fā)現(xiàn)對10 種及以上抗生素耐藥的菌株占比達34%，四環(huán)素類耐藥基因tetC 檢出率100%[2]。 以上數(shù)據(jù)顯示犢牛腹瀉大腸桿菌多重耐藥菌普遍存在。（基金項目：河北省教育廳青年基金項目（項目編號：QN2017305）；張家口市科技局科技計劃項目（項目編號：2121027C）河北省二期農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系奶牛創(chuàng)新團隊建設專項資金HBCT2018120407）

表1 分離大腸桿菌藥物敏感性檢測結果