康翠翠，張妹，陳小嬌，陳文平

（北京市華都峪口禽業(yè)有限責任公司、國家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術體系平谷綜合試驗站，北京平谷 101206）

目前，養(yǎng)禽業(yè)是我國主流畜牧養(yǎng)殖業(yè)之一，然而，隨著禽類各種疾病的暴發(fā)，對雞群的健康產(chǎn)生巨大的影響。 為了確保雞群健康，除做好生物安全外， 疫苗也是保護雞群健康必不可少的一員。 蛋白質和內(nèi)毒素含量是評價疫苗的兩種指標。 疫苗中的蛋白質含量過高會促使機體產(chǎn)生一些生物活性物質，進而引發(fā)機體產(chǎn)生反應。而疫苗中的內(nèi)毒素會作用于單核巨噬細胞和多形核白細胞，進而產(chǎn)生一些活性因子，導致機體產(chǎn)生應激反應[1]。 然而對于禽類疫苗，目前尚未有關于蛋白質和內(nèi)毒素含量的明確規(guī)定。 本文對市場上的幾種禽類疫苗進行蛋白質和內(nèi)毒素檢測， 擬了解目前禽類疫苗蛋白質和內(nèi)毒素含量情況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

CBA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型）購買自碧云天生物技術公司，鱟試劑（靈敏度0.25 EU/毫升）和細菌內(nèi)毒素工作標準品（10 EU/支）均購自湛江安度斯生物有限公司， 細菌內(nèi)毒素檢查用水購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司。 各種禽用疫苗由各公司提供。 疫苗具體信息如表1。

表1 試驗所用疫苗名稱及廠家

1.2 試驗方法

1.2.1 總蛋白質測定

1.2.1.1 前期處理

參考《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2078號》測定疫苗蛋白質含量。 將疫苗從冰箱中取出使其恢復至常溫，上下顛倒使其混合均勻，從中取出100 微升置于1.5 毫升離心管中，加入900微升丙酮， 充分混勻后于室溫放置10 分鐘，15000 克4℃離心15 分鐘，去除上清液。 向沉淀中加入400 微升丙酮，震蕩后短暫離心，去除上清液。 再次用400 微升丙酮洗滌沉淀，震蕩后短暫離心去除上清液，將離心管蓋打開，室溫晾干直至沉淀物為粉末狀。 每管添加100 微升去離子水，置于超聲波中超聲20 分鐘，使其充分溶解。 每種疫苗重復3 次。

1.2.1.2 蛋白質含量檢測

蛋白質檢測流程嚴格按照CBA 蛋白濃度測定試劑盒進行。

1.2.2 內(nèi)毒素檢測

1.2.2.1 疫苗前期處理

參考宋海巖等[2]的凍融方法， 取12 毫升混合均勻后的疫苗于15 毫升離心管中，置于-20℃冰箱冷凍48 小時， 取出后使其于室溫中融化，完全融化后再次置于-20℃冰箱冷凍24 小時， 取出后置于室溫中融化，3500 克離心15 分鐘，棄去上層乳狀物，吸取下層水相于5 毫升離心管中。

1.2.2.2 內(nèi)毒素限度試驗

參考2015 年版《中國藥典》 中細菌內(nèi)毒素含量檢測方法。取內(nèi)毒素標準品一只，加入1 毫升檢查用水，旋渦混勻5 分鐘。后期利用檢查用水分別制備濃度為4λ 和2λ 的內(nèi)毒素標準品液。 利用檢查用水進行供試品稀釋，和4λ 內(nèi)毒素標準品液共同配制濃度為2λ 的供試品溶液。

取鱟試劑42 只，其中2 只為陰性對照管，2只為陽性對照管， 其余每4 只用于一種疫苗的檢測，2 只為供試品檢查管，2 只為供試品陽性對照管。 每只鱟試劑中加入0.1 毫升檢查用水，其中陰性對照管再次加入0.1 毫升檢查用水，陽性對照管加入0.1 毫升濃度為2λ 的內(nèi)毒素標準品溶液，供試品檢查管加入0.1 毫升稀釋后的供試品，供試品陽性對照管中加入濃度為2λ 的供試品溶液。 封閉鱟試劑管口，輕輕搖勻，將鱟試劑管垂直放入37℃恒溫箱中孵育60 分鐘，取出觀察，在取出過程中避免振動。 將試管緩慢倒轉180°，若管底形成凝膠且凝膠不變形不從管壁脫落為陽性，若管底未形成凝膠、凝膠變形或從管壁脫落均為陰性。 陰性對照管需為陰性，陽性對照管和供試品陽性管需為陽性， 整個試驗結果才有效。

2 結果

2.1 蛋白質標準曲線

嚴格按照CBA 試劑盒制作標準曲線。 如下圖1 所示，表中線性相關系數(shù)R2=0.9995，顯著相關。

圖1 按照CBA 試劑盒制作的曲線

2.2 疫苗蛋白質結果

從表2 可知，按照生產(chǎn)廠家進行分析，發(fā)現(xiàn)不同廠家的疫苗蛋白質含量不同。 綜合而言，除鋁膠苗外，B 廠家疫苗蛋白質含量最高， 其次是廠家D， 兩家蛋白含量均在1000 微克/毫升以上； 廠家C 和F 蛋白含量在500～1000 微克/毫升內(nèi)；廠家A 和E 蛋白質含量在500 微克/毫升以下。

表2 各廠家各疫苗蛋白質含量

按照單苗與聯(lián)苗進行分析， 發(fā)現(xiàn)單苗和聯(lián)苗間蛋白質含量并無明顯關系。

按照油苗和鋁膠苗進行分析， 發(fā)現(xiàn)B 廠家中油苗中蛋白質含量高于鋁膠苗。

2.3 鱟試劑靈敏度復核試驗

取細菌內(nèi)毒素工作標準品一只用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，旋渦混合后進行稀釋，制成濃度為0.50、0.25、0.125 和0.06 EU/毫升的內(nèi)毒素標準品。 取鱟試劑安剖瓶18 支，分別為陰性對照2 支，各濃度內(nèi)毒素標準品4 支。 將鱟試劑用0.1 毫升檢查用水溶解后，分別加入各濃度內(nèi)毒素標準品0.1 毫升，陰性對照管加入0.1 毫升檢查用水。 輕輕混勻后封閉管口，垂直放入37℃恒溫箱中60 分鐘，觀察結果。

從表3 可知， 鱟試劑復核結果中細菌內(nèi)毒素濃度為0.50 EU/毫升時為陽性，內(nèi)毒素濃度為0.06 EU/毫升時凝膠結果為陰性，說明試驗結果有效。 本次靈敏度復核試驗顯示本試驗所用鱟試劑靈敏度為0.25 EU/毫升，與其標識靈敏度一致。

表3 鱟試劑靈敏度復核試驗結果

2.4 內(nèi)毒素凝膠限度試驗

按照中國藥典方法對各疫苗進行內(nèi)毒素檢測。 如表4 可知，8 種疫苗中有3 種疫苗內(nèi)毒素含量大于50EU/毫升，其余5 種疫苗含量均小于50 EU/毫升。

表4 各廠家各疫苗內(nèi)毒素含量

3 討論

本文參考農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的檢測口蹄疫滅活苗蛋白質含量方法對各種疫苗進行總蛋白質含量檢測，參考中國藥典2015 版細菌內(nèi)毒素含量檢測方法檢測各疫苗內(nèi)毒素含量。 結果顯示不同疫苗其蛋白質含量和內(nèi)毒素含量差異明顯，尤其是蛋白質含量差異較大。 疫苗中雜蛋白質含量過高可能會引起雞群局部發(fā)熱， 停食甚至死亡。

目前對于禽類疫苗中蛋白質含量未有明顯的規(guī)定。 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的口蹄疫疫苗中蛋白質含量為小于500 微克/毫升， 疫苗內(nèi)毒素含量為小于50 EU/毫升。 本研究中疫苗蛋白質含量最低為B 廠家的傳染性鼻炎 （A 型） 滅活疫苗（鋁膠苗）182 微克/毫升， 最高為B 廠家的禽腦脊髓炎滅活疫苗， 蛋白含量可達3822 微克/毫升，遠超500 微克/毫升。兩種疫苗蛋白含量差距可達20 倍。 說明疫苗蛋白質含量與生產(chǎn)廠家無必要聯(lián)系，可能與疫苗制備工藝有關。 本文檢測的8 種疫苗中其中5 種疫苗蛋白含量超過500微克/毫升， 說明目前禽用疫苗中蛋白質含量較高。

疫苗中內(nèi)毒素含量是目前各方最為關注的問題， 疫苗內(nèi)毒素含量過高會影響機體健康[2]。本研究檢測的8 個疫苗中有3 個疫苗內(nèi)毒素含量超過50 EU/毫升， 說明大部分疫苗內(nèi)毒素含量低于50 EU/毫升。 此外內(nèi)毒素含量大于50 EU/毫升的疫苗分別屬于3 個廠家，說明內(nèi)毒素含量的高低與廠家并無直接關系， 與各疫苗的制作工藝有關。

本文通過對市場上禽類疫苗進行蛋白質和內(nèi)毒素含量檢測， 初步了解禽類疫苗中蛋白質和內(nèi)毒素的含量范圍， 為后期疫苗中蛋白質和內(nèi)毒素的檢測提供了方法， 同時為疫苗的質量評估提供了數(shù)據(jù)支撐。