鄭瑞龍，楊傳佳，鈕成拓，鄭飛云，王金晶，李 崎，劉春鳳*

（1.工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室（江南大學(xué)），江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

米酒是以糯米為主要原料，經(jīng)液化、糖化、發(fā)酵釀造而成[1]。我國糯米釀酒歷史悠久。傳統(tǒng)米酒多為固態(tài)或半固態(tài)發(fā)酵，經(jīng)浸米、蒸煮、加曲、發(fā)酵、壓榨、澄清、煎酒、陳化、勾兌等步驟，采用“酒曲復(fù)式發(fā)酵法”[2]。一般認(rèn)為，米曲是米酒釀造過程中重要微生物來源，可為米酒釀造過程提供淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等豐富酶系，但傳統(tǒng)米酒生產(chǎn)工藝效率較低，能耗較高，浸米廢水對環(huán)境污染嚴(yán)重，且無法保障米酒批間風(fēng)味穩(wěn)定性[3]。如今，酶制劑在釀造業(yè)應(yīng)用廣泛，盛鳳云等利用高溫淀粉酶將粉碎原料粉碎后液化，取代傳統(tǒng)工藝中的浸米和蒸米，并初步估算能量，可節(jié)省50%以上[4]。張敏將酶法液化的糯米粉進一步添加糖化酶和麥曲進行多酶釀造米酒[5]。但目前液態(tài)發(fā)酵米酒多為酒曲與酶制劑協(xié)同作用，中國釀酒協(xié)會曾提出從傳統(tǒng)雙邊發(fā)酵改為先糖化后發(fā)酵的清液發(fā)酵技術(shù)可行[6]。與傳統(tǒng)發(fā)酵米酒（曲和酵母聯(lián)合處理）相比，使用酶法液化制備糯米糖液，接種純種酵母液態(tài)米酒，使米酒產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)更可控，并且可以提高勞動生產(chǎn)率和機械水平，有利于現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。

酵母性能優(yōu)劣不僅決定米酒釀造效率，還影響米酒風(fēng)味品質(zhì)[7-8]。我國傳統(tǒng)米酒酒曲中含有多種微生物，其中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是酒曲中主要產(chǎn)酒精功能菌，對米酒質(zhì)量和發(fā)酵效率有較大影響[9-10]。酒曲中酵母包括酵母屬、假絲酵母屬、復(fù)膜孢酵母屬和畢赤酵母屬等[2]，目前對適用于米酒純種發(fā)酵的釀酒酵母研究較為缺乏。伍保龍等從米酒酒曲中分離得到產(chǎn)酒精能力強的釀酒酵母，但并未對其風(fēng)味進行分析及米酒純種發(fā)酵[11]。鄒凌波使用從酒曲和米酒醪中分離得到的釀酒酵母協(xié)同糖化酶進行雙邊發(fā)酵[12]。對于適用于純液態(tài)發(fā)酵的釀酒酵母篩選應(yīng)用仍鮮有報道，菌株多樣化為釀造酒生產(chǎn)提供豐富多樣性[13]，篩選適用于液態(tài)米酒純種發(fā)酵的釀酒酵母具有重要價值與意義。為此，本研究以分離自米曲樣品中潛在釀酒酵母和實驗室保藏共計198株菌株為研究對象，測定其產(chǎn)氣能力、乙醇生產(chǎn)能力和發(fā)酵速率等，并分析菌株發(fā)酵所得米酒理化指標(biāo)、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及其香氣貢獻，最終得到具有優(yōu)良潛力的釀酒酵母。該研究對純種發(fā)酵液態(tài)米酒開發(fā)具有重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米購置于當(dāng)?shù)厥袌?；米曲購自四川、湖北、江西、廣西、云南、江蘇等地區(qū)；菌株YSHJ為上海某酒廠提供，應(yīng)用于米酒發(fā)酵，為釀酒酵母屬。有機酸、揮發(fā)性化合物標(biāo)準(zhǔn)品為色譜純，購自美國Sigma-aldrich公司；試驗藥品均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：用于酵母培養(yǎng)，主要成分包括葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母粉10 g，瓊脂粉20 g（用于固體培養(yǎng)基），蒸餾水1 000 mL，115℃滅菌15 min；

商業(yè)Biggy agar培養(yǎng)基：由青島海博生物技術(shù)有限公司提供；

TTC底層培養(yǎng)基：葡萄糖50.5 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏7.5 g，酸性磷酸鉀5 g，硫酸鎂2 g，檸檬酸1.35 g，瓊脂30 g，115℃滅菌15 min，滅菌冷卻后加入氨芐青霉素1.0 g；TTC上層培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖0.5 g，瓊脂15 g，115℃滅菌15 min，冷卻后加入TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）0.5 g。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌株分離

購買來自四川、湖北、江西、廣西、云南、江蘇等地區(qū)12種米酒酒曲。分別取2 g酒曲樣品添加至含玻璃珠50 mL無菌生理鹽水中，25℃、180 r·min-1活化20 min后，將菌液稀釋涂布至添加含有1 g·L-1丙酸鈉、25 mg·L-1氨芐抗菌YPD固體平板中，28℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況。挑選出具有形態(tài)圓形、表明光滑、邊緣整齊菌落，在YPD平板上作二次劃線分離，純化分離物接入YPD液體甘油管中于-80℃保存，并編號。

1.3.2 菌株起始發(fā)酵能力

將甘油管保藏菌株接種于YPD液體試管中，28℃、180 r·min-1培養(yǎng)活化2次后接種至糖度為11%含杜氏小管糯米汁培養(yǎng)基中，25℃靜置培養(yǎng)48 h，保留起酵速度快菌株用于下一級篩選。

1.3.3 菌株硫化氫生成能力

在YPD液體試管中活化起酵能力較好菌株，在Biggy agar平板上點樣5μL過夜培養(yǎng)物，28℃靜置培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落顏色選擇低產(chǎn)或不產(chǎn)硫化氫菌株用于下一級篩選（菌落顏色越淺，硫化氫生成能力越低）。

1.3.4 菌株乙醇生成能力

將以上篩選得到酵母菌株在YPD液體試管中活化，在TTC下層平板上點樣5μL，28℃培養(yǎng)24～48 h，倒入TTC上層培養(yǎng)基，28℃避光培養(yǎng)2～4 h，挑選菌落顏色較深，產(chǎn)酒精能力強菌株。

1.3.5 糯米汁糖液制備

粉碎糯米按照料水質(zhì)量比1∶6，于50℃投料。添加高溫α-淀粉酶，升溫至95℃，保溫30 min，升溫至100℃，煮沸10 min；冷卻至50℃，按200 U·g-1糯米添加蛋白酶，保溫30 min；升溫至62℃，按180 U·g-1糯米添加糖化酶，保溫120 min；過濾后煮沸10 min。所得糯米糖液根據(jù)需要稀釋成目標(biāo)糖度，于高壓蒸汽滅菌鍋中105℃滅菌10 min。

1.3.6 液化法米酒發(fā)酵試驗

在糯米汁中接種釀酒酵母菌株，以米酒酵母YSHJ為對照。

具體發(fā)酵方法為：糯米汁糖度16%，發(fā)酵規(guī)模500 mL，裝液量60%，發(fā)酵體系中酵母接種量為107cfu·mL-1，25℃發(fā)酵，并監(jiān)測其失重，直至24 h內(nèi)失重＜0.2 g·300 mL-1，發(fā)酵結(jié)束后離心過濾獲得米酒。每批次發(fā)酵設(shè)置3個生物學(xué)平行。

1.3.7 液化法米酒分析檢測

1.3.7.1 米酒理化指標(biāo)測定

米酒理化指標(biāo)分析過程參照黃酒國家標(biāo)準(zhǔn)[14]和《釀酒工業(yè)分析》[15]方法。

1.3.7.2 米酒有機酸含量測定

將酒樣適當(dāng)稀釋后，經(jīng)C18固相萃取柱過濾后用0.22μm水系濾膜過濾備用。

色譜條件：色譜柱Waters X select HSS T3（4.6 mm×250 mm）；流動相：0.02 mol·L-1（pH 2.5）磷酸二氫鉀緩沖液；流速：0.5 mL·min-1；檢測波長：210 nm；進樣量：10μL；柱溫30℃。根據(jù)峰保留時間和其峰面積與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品比較，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線作定量測定。

1.3.7.3 米酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

通過SPME-GC-MS測定米酒中揮發(fā)性化合物，酒樣處理條件為：將8 mL酒樣加入20 mL潔凈螺口頂空瓶中，并加入2.0 g NaCl和2-辛醇內(nèi)標(biāo)（終濃度50μg·L-1）。45℃預(yù)熱5 min，萃取60 min。萃取結(jié)束后，將75μm Car/PDMS萃取頭插入進樣口，250℃解吸附5 min。分析條件為：EG-20 m彈性石英毛細(xì)管柱，30 m×0.25 m×0.25μm；載氣為高純氦氣，恒定流量為0.8 mL·min-1；升溫程序：從180℃開始，保持2 min，以3℃·min-1升溫到230℃，保持10 min；進樣口溫度250℃，出樣口溫度200℃；檢測電壓350 V。

MS條件：EⅠ離子源，發(fā)射電流200μA，電子能量70 eV，掃描范圍20～550 U。未知化合物定性通過與NⅠST 05質(zhì)譜庫中標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對確定，化合物定量通過在體積分?jǐn)?shù)10%乙醇溶液中配制待測化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)定量化合物與內(nèi)標(biāo)化合物峰面積比值與定量化合物濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定果酒中揮發(fā)性化合物濃度。

1.3.8 米酒感官品評

感官品評小組由2名具有專業(yè)品評經(jīng)驗老師和8名經(jīng)酒類品評訓(xùn)練并選拔出的研究生組成，小組成員定期開展米酒感官品評訓(xùn)練后作為品評員完成感官品評。感官品評評分和評價標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[2]。

表1 感官品評評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Organoleptic evaluation criteria

1.3.9 菌株18S rDNA鑒定

將甘油管保藏菌株于10 mL YPD培養(yǎng)基中，28℃、180 r·min-1過夜活化，隨后轉(zhuǎn)接至10 mL YPD培養(yǎng)基中，28℃、180 r·min-1培養(yǎng)18～24 h。取適量培養(yǎng)液離心1 min（12 000 r·min-1），棄上清，采用酵母DNA提取試劑盒提取菌體DNA，選用酵母ⅠTS通用引物（ⅠTS1-F:5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3′;ⅠTS4-R:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′）擴增基因組DNA，測序PCR產(chǎn)物。采用BLAST方式將測定的18S rDNA序列與Gen-Bank中酵母菌序列作比對，構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理與分析

研究使用GraphPad Prism 8.4.3繪圖，使用SPSS 26.0作顯著性、主成分等統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)為3個獨立試驗平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株篩選

試驗從米曲樣品中分離得到菌株108株及實驗室保藏菌株90株，共198株菌株用于下一步試驗（見表2），表中短線以上數(shù)目為進入下一篩選階段菌株個數(shù)。

表2 菌株篩選結(jié)果Table 2 Screening results of strains

對試驗菌株作杜氏小管發(fā)酵試驗，25℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h。結(jié)果表明，57株氣體全部充滿杜氏小管且均有一定酒精感，47株氣體占杜氏小管2/3，該104株為起酵能力較優(yōu)菌株。酵母在發(fā)酵過程中伴隨含硫化合物合成而產(chǎn)生H2S，H2S揮發(fā)性較強，具有臭雞蛋不愉悅氣味。通過使用BⅠGGY瓊脂培養(yǎng)基顯色程度對杜氏小管篩選得到酵母產(chǎn)H2S能力作表征。其中29株菌株菌落為白色或黃色，認(rèn)為其低產(chǎn)硫化氫。進一步通過TTC篩選平板，選擇菌落顏色深紅色產(chǎn)酒精能力強10株菌株開展后續(xù)研究。

調(diào)整糯米汁發(fā)酵培養(yǎng)基糖度為12%，接種10株菌株，并以米酒酵母YSHJ為對照，該菌株為酒廠提供，并已應(yīng)用于米酒生產(chǎn)。測定發(fā)酵速度與酒精度。各菌株發(fā)酵速率根據(jù)其CO2生成速度判斷，斜率越大則發(fā)酵速度越快，結(jié)果如圖1顯示，菌株21和26的CO2失重最高，分別為4.86和4.84 g。菌株13和40發(fā)酵速度最慢。所有菌株中，有7株菌株酒精度高于對照菌株。

圖1 不同菌株發(fā)酵性能Fig.1 Fermentation ability of different strains

2.2 米酒發(fā)酵

基于上述試驗篩選得到7株發(fā)酵性能較為優(yōu)良菌株，開展米酒發(fā)酵試驗，同時以米酒酵母YSHJ為對照組，發(fā)酵完成后，分析其基礎(chǔ)理化指標(biāo)、揮發(fā)性風(fēng)味化合物。

2.2.1 米酒理化指標(biāo)分析

米酒基礎(chǔ)理化指標(biāo)如表3所示，除菌株30和127發(fā)酵時間較長，12 d完成發(fā)酵，其余菌株發(fā)酵時間均為10 d。不同菌株發(fā)酵米酒酒精度為7.02%～7.19%V/V，無顯著差異，菌株21、30、184發(fā)酵米酒殘?zhí)歉哂趯φ站闥SHJ。相較于對照菌株，菌株26、89和167發(fā)酵米酒具有更高酒精度和更少殘?zhí)?，具有潛在發(fā)酵優(yōu)勢。除菌株21、26具有較高總酸含量外，其余菌株發(fā)酵米酒總酸含量低，適量酸可提高米酒品質(zhì)。菌株21、26、127和167所得米酒具有較高甘油含量，甘油是酵母酒精發(fā)酵過程中主要副產(chǎn)物之一，可為酒體提供圓潤、柔滑口感，一定含量甘油可增加米酒復(fù)雜性。

表3 米酒理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical indices of rice wine

2.2.2 米酒有機酸含量分析

米酒中有機酸種類豐富，共檢出有機酸8種，其中含量最高兩種有機酸為檸檬酸和乳酸。有機酸有助于穩(wěn)定酒體香氣，提高酒品質(zhì)，但含量過高則表現(xiàn)酸感突出、酒質(zhì)粗糙。檸檬酸酸味較長，口感圓潤清爽，但過量則辣口[16]，對照菌株發(fā)酵所得米酒產(chǎn)生的檸檬酸為0.71 g·L-1，是所有菌株中產(chǎn)檸檬酸量最高菌株。乳酸口感柔和，增加酒體醇厚度[17]，菌株167發(fā)酵的米酒乳酸含量最高，達0.55 g·L-1，作為一種溫和有機酸，更高濃度乳酸可能使酒體更柔滑。琥珀酸又稱丁二酸，具有酸味和咸苦味可調(diào)和酒體，其可形成丁二酸二乙酯等化合物，對酒的風(fēng)味具有重要影響[18]，菌株21、26、127和30發(fā)酵的米酒均具有含量較高的琥珀酸。蘋果酸酸感清爽，呈味持久且略帶刺激性，菌株之間蘋果酸含量差異小，占總有機酸含量12%～15%（見表4）。

表4 米酒有機酸組成Table 4 Organic acid components of rice wine (g·L-1)

2.2.3 米酒感官品評

按照黃酒品評描述對米酒作感官品評，表5顯示各菌株發(fā)酵所得米酒感官品評得分結(jié)果。所有菌株發(fā)酵米酒色澤差異較小，酒體澄清透明，但光澤較弱。香氣指標(biāo)下各菌株具有一定差異，其中菌株21、26發(fā)酵米酒香氣較為馥郁，酒香純正且有糯米香，菌株184和YSHJ發(fā)酵米酒酒香較為突出，但米香略弱，菌株89和127發(fā)酵米酒香氣愉悅度低，有輕微異雜味，整體酒香、米香不足。發(fā)酵米酒酒體普遍清爽柔和，其中，菌株21、26和YSHJ發(fā)酵米酒的酒體更為協(xié)調(diào)，酸甜度較為適中。菌株127發(fā)酵米酒具有明顯辣口感和酸感，口感較差。典型性上雖得分差異小，但菌株21、26和YSHJ發(fā)酵米酒相較于其他菌株米酒發(fā)酵香氣更為突出。因此，將進一步測定各菌株發(fā)酵米酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以分析其特點。

表5 米酒感官品評得分Table 5 Organoleptic evaluation of rice wine

2.2.4 米酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成分析

通過GC-MS檢測8種不同菌株發(fā)酵米酒中揮發(fā)性風(fēng)味化合物，共檢測到揮發(fā)性化合物84種，其中包含25種醇類化合物，30種酯類化合物，8種酸類化合物12種醛酮類化合物和其他類化合物9種。菌株27發(fā)酵米酒揮發(fā)性風(fēng)味化合物種類最多，為60種。菌株67發(fā)酵米酒最少，為50種。菌株YSHJ、21和26發(fā)酵的米酒檢出55種，菌株30、89和104發(fā)酵米酒分別檢出56種、53種和54種揮發(fā)性風(fēng)味化合物（數(shù)據(jù)未顯示）。酯類化合物作為米酒中種類最多的揮發(fā)性化合物，主要以乙酯為主，如癸酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯等。醇類化合物含量最高分別為異戊醇、苯乙醇和異丁醇。

在所有化合物中，以醇酯類化合物含量最為豐富，可占到揮發(fā)性化合物總量87.08%～91.47%（見圖2）。作為對照菌株，YSHJ發(fā)酵米酒中，醇類化合物相對含量69.39%，酯類化合物占比19.64%，酸類化合物占比7.54%，醛酮酚類化合物占比3.28%。酯類化合物可促進果香和花香等香氣產(chǎn)生[19]，對米酒香氣發(fā)揮積極作用，菌株26和30所得發(fā)酵酒中酯含量較高，占總揮發(fā)性風(fēng)味化合物24.22%和24.96%，其酸類化合物含量也相對較高，分別為9.75%和11.30%，適量的酸可提高酒的復(fù)雜程度和協(xié)調(diào)性。菌株89、167和184所得米酒醇類化合物占比在70%以上，菌株184發(fā)酵所得米酒中醇類化合物占比為所有菌株最高，為76.52%，高濃度醇類會產(chǎn)生刺激性氣味和苦澀味道[20]。

圖2 米酒揮發(fā)性風(fēng)味化合物組成Fig.2 Composition of volatile compound in rice wine

揮發(fā)性風(fēng)味化合物對香氣的貢獻更多取決于其風(fēng)味閾值和在酒中實際含量。因此，選取酯類含量較為豐富的菌株21、26、30、127和YSHJ，對其米酒中22種揮發(fā)性風(fēng)味化合物作定量分析。

米酒中醇類物質(zhì)除乙醇外，主要為高級醇。高級醇是在發(fā)酵過程中，通過氨基酸脫羧和脫氨基形成。高級醇在酒中可使酒體更豐滿濃郁，但高級醇含量過高不僅破壞酒體協(xié)調(diào)，更易對人體造成損傷[21]，一般情況下發(fā)酵啤酒中高級醇含量＜100 mg·L-1，黃酒中高級醇含量為8～540 mg·L-1，葡萄酒中高級醇認(rèn)為＜300 mg·L-1[22]。異戊醇、異丁醇、苯乙醇和正丙醇是米酒中最主要高級醇。異戊醇、異丁醇具有明顯刺激性氣味和苦澀感，菌株127發(fā)酵米酒具有最高異戊醇產(chǎn)量（61.33 mg·L-1），菌株YSHJ發(fā)酵米酒具有最高異丁醇含量（67.99 mg·L-1）。苯乙醇可產(chǎn)生類似玫瑰、香甜和丁香的香氣，是米酒中獨特風(fēng)味化合物[23]，菌株YSHJ、127和26發(fā)酵米酒中苯乙醇產(chǎn)量較高，分別為10.24、9.04、7.68 mg·L-1，作為米酒釀造菌株可為米酒提供典型米酒香氣。

酯類化合物是黃酒香氣成分中含量第二高的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸異戊酯和丁酸乙酯是米酒中含量較高的酯類化合物。其中，乙酸乙酯在各菌株中含量最高，為5.88～6.90 mg·L-1，作為米酒中主要酯類風(fēng)味化合物之一，乙酸乙酯酒有積極的香氣貢獻。乳酸乙酯在菌株21和30發(fā)酵所得米酒中未檢出，在其他菌株發(fā)酵米酒中含量為2.63～2.67 mg·L-1。乙酸異戊酯具有香蕉風(fēng)味。中鏈脂肪酸乙酯，如丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯可提供令人愉悅的果香。

表6 米酒中揮發(fā)性風(fēng)味化合物定量分析Table 6 Quantitative analysis of volatile compounds in rice wine

2.2.5 米酒主要揮發(fā)性化合物OAV

香氣活力值（Odor activity value，OAV）用于表征化合物對樣品香氣的貢獻程度，通過該揮發(fā)性風(fēng)味化合物在樣品中濃度與該化合物氣味閾值比值計算[24]，OAV大于1則表示該化合物對酒整體香氣具有明顯貢獻[25]。

由表7可知，根據(jù)OAV計算結(jié)果，22種揮發(fā)性化合物中共有13種化合物OAV＞1，是關(guān)鍵香氣化合物。苯乙醇作為米酒中具有特征風(fēng)味的化合物，其在4個菌株發(fā)酵米酒中香氣活力均不及對照菌株YSHJ，但菌株127和菌株26所得米酒相對較高，分別為1.81和1.54。乙酸異戊酯、丁酸乙酯和癸酸異戊酯OAV＞10，乙酸異戊酯具有香蕉、水果特征香氣，丁酸乙酯具有白蘭地、水果特征香氣，癸酸異戊酯具有香蕉、青草和白蘭地特征香氣。這些化合物可給酒體貢獻積極的果香味，但癸酸異戊酯在菌株127所得米酒中并未檢出。結(jié)合感官品評結(jié)果，YSHJ和菌株127發(fā)酵米酒香氣得分較低，酒精感較明顯，與其異丁醇和異戊醇濃度較高有關(guān)。

表7 主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物OAV及香氣描述Table 7 Odor activity value and aroma description of volatile compounds

芳樟醇和十六酸乙酯在除菌株21以外菌株所發(fā)酵米酒中均有檢出，芳樟醇雖含量較低，但菌株26、30和127發(fā)酵米酒對應(yīng)OAV＞1，可為酒提供花香和薰衣草香氣。十六酸乙酯具有果香、奶油香特征香氣，OAV＞4，菌株26發(fā)酵米酒十六酸乙酯OAV最高，為4.32。中、長鏈脂肪酸乙酯被認(rèn)為是米酒中具有代表性的重要風(fēng)味化合物[27]。

酸類物質(zhì)是釀造酒中重要呈味物質(zhì)，可賦予酒體協(xié)調(diào)的口感。但高濃度下，產(chǎn)生脂肪、腐臭等異味，給酒帶來負(fù)面影響[28-29]，例如高含量辛酸造成酒風(fēng)味品質(zhì)下降。菌株127發(fā)酵米酒的酸類化合物OAV普遍高于其他菌株。菌株26發(fā)酵的米酒中酸類化合物OAV較低，感官評價香氣較為馥郁和諧。

對OAV值大于1的13種揮發(fā)性化合物作主成分分析。如圖3所示，前兩個PC描述67.55%方差，其中第一主成分PC1占方差46.22%，與癸酸異戊酯呈負(fù)相關(guān)。第二主成分PC2占方差21.33%，與十六酸乙酯、芳樟醇等呈正相關(guān)，與乙酸乙酯、正癸酸呈負(fù)相關(guān)?；衔镏g主成分得分有重疊，表明其含量具有相似特征。

圖3 米酒主成分分析Fig.3 Principal components analysis of rice wine

基于PC1和PC2計算得到每個菌株酒樣樣本分?jǐn)?shù)，F(xiàn)AC1和FAC2，分別對應(yīng)圖B中x和y軸，該圖顯示5株樣品在坐標(biāo)系中差異，樣品相距越遠(yuǎn)其差異值越大。

綜合上述研究，菌株NO.26發(fā)酵速度快，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成較優(yōu)，感官評價酒體協(xié)調(diào)，香氣馥郁，且?guī)в忻拙泼紫闩c清香，具有純種發(fā)酵優(yōu)質(zhì)米酒的潛力。

2.3 菌株鑒定

初步篩選獲得優(yōu)選菌株NO.26，提取菌體DNA后，采用BLAST方式將測定的18S rDNA序列與GenBank中序列作比對，生成系統(tǒng)發(fā)育樹。所有篩選菌株與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CBS 1 171模式菌株形成一個簇，表明篩選菌株為釀酒酵母，結(jié)果如圖4所示。

圖4 基于18S r DNA測序所構(gòu)建酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of yeast based on 18S r DNA sequencing

3 討論與結(jié)論

優(yōu)質(zhì)酵母菌株對于釀造酒發(fā)酵至關(guān)重要，對口感和風(fēng)味均影響極大[30]。目前，對于米酒或黃酒酵母篩選多基于傳統(tǒng)釀造工藝，選育具有低產(chǎn)尿素[31]、低產(chǎn)高級醇[32]、高產(chǎn)β-苯乙醇[33]等菌株，對于篩選適用于純種液態(tài)米酒發(fā)酵的酵母菌株研究較少。純種釀酒酵母分離和應(yīng)用，有利于米酒釀造向現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)進一步邁進[3]。王瑩鈺使用6種黃酒酵母發(fā)酵液化法糜子黃酒，不同菌株之間發(fā)酵速率、乙醇產(chǎn)量和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成等存在顯著差異[34]。鄒凌波建立一種酶制劑完全替代酒曲液態(tài)米酒釀造工藝，并從酒曲和酒醪中篩選得到1株發(fā)酵能力較優(yōu)釀酒酵母，但并未根據(jù)其風(fēng)味特性和感官品評進一步分析篩選[12]。

本試驗以米酒酒曲和實驗室保藏菌株為篩選源，基于菌株產(chǎn)氣、產(chǎn)硫化氫、產(chǎn)酒精試驗，發(fā)酵性能試驗和揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析，篩選獲得優(yōu)良釀酒酵母菌株NO.26。該菌株在糖度16%糯米糖液中，25℃發(fā)酵10 d可產(chǎn)生酒精度為7.19%V/V米酒，發(fā)酵速率快，產(chǎn)酒精能力強。使用該菌株發(fā)酵所得米酒中多種揮發(fā)性風(fēng)味化合物如苯乙醇、芳樟醇、十六酸乙酯等均優(yōu)于其他菌株或處于較高水平，釀造米酒具有發(fā)酵米酒典型米香和清香，口感清爽鮮甜，感官品評結(jié)果優(yōu)于其他菌株。

目前，適用于米酒發(fā)酵的菌株多樣性不足，嚴(yán)重限制米酒風(fēng)格豐富性。研究對酵母菌株發(fā)酵特性提供系統(tǒng)的選育方法，并篩選得到具有優(yōu)良釀造品質(zhì)的釀酒酵母，對于未來開發(fā)純種液態(tài)法米酒產(chǎn)品具有較強工業(yè)應(yīng)用參考。