楊雨虹，李明帥,，羅 亮，王世會(huì)，張 瑞，郭 坤，劉金雨,3，李海濤,3，趙志剛*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江省冷水性魚類種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150070；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 200090）

我國(guó)鹽堿水資源豐富，但卻不能為人畜飲用，也無法直接運(yùn)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。通過漁業(yè)手段有效開發(fā)和利用鹽堿水域資源，對(duì)拓展水產(chǎn)養(yǎng)殖空間、保障水產(chǎn)品供給、實(shí)現(xiàn)鹽堿環(huán)境生態(tài)修復(fù)具有重要意義[1]。

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已將鹽堿水養(yǎng)殖作為十大模式之一，列入《2020年水產(chǎn)生態(tài)健康養(yǎng)殖模式示范行動(dòng)方案》[2]。鹽度和堿度作為鹽堿水養(yǎng)殖過程中重要水質(zhì)參數(shù)，顯著影響水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝、組織功能等方面[2-3]。水生動(dòng)物鹽堿耐受性是遺傳因素和環(huán)境長(zhǎng)期共同作用結(jié)果。開展水生動(dòng)物鹽堿耐受能力研究，對(duì)揭示其耐鹽堿機(jī)制、開發(fā)耐鹽堿水產(chǎn)養(yǎng)殖品種具有重要意義。目前，研究人員對(duì)鯽（Carassius auratus）[4]、羅氏沼蝦（Macrobrochium rosenbergii）[5]、凡 納 濱 對(duì) 蝦（Litopenaeus vannamei）[6]、大鱗鲃（Barbus capito）[7]等養(yǎng)殖品種鹽堿耐受能力開展相關(guān)研究。

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）屬十足目（Decapoda）、方蟹科（Grapsidae）、絨螯蟹屬，俗稱河蟹，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動(dòng)物。自然條件下，中華絨螯蟹生活史較為復(fù)雜，幼蟹和成體主要生長(zhǎng)在淡水中，而親本繁殖行為及幼體發(fā)育均需在半咸水中完成[8]。研究表明，鹽度變化可顯著影響中華絨螯蟹攝食生長(zhǎng)、性腺發(fā)育、繁殖行為、組織生理、能量代謝、機(jī)體免疫等[9-11]。目前，關(guān)于堿度及鹽堿交互脅迫對(duì)中華絨螯蟹相關(guān)方面研究極少。本研究通過測(cè)定中華絨螯蟹對(duì)氯化鈉鹽度、碳酸氫鈉堿度以及鹽堿交互作用耐受能力，探究中華絨螯蟹對(duì)鹽堿水域環(huán)境生理耐受性，為中華絨螯蟹鹽堿水養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用蟹為中華絨螯蟹，來自遼寧盤錦。挑選體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊、附肢完整幼蟹用于試驗(yàn)，平均體質(zhì)量為（8.33±1.76）g，平均體寬為（25.6±2.1）mm，平均體長(zhǎng)為（24.7±1.8）mm。試驗(yàn)開始前在玻璃水箱中暫養(yǎng)15 d，暫養(yǎng)期間每日定量投喂，持續(xù)充氧，每日換水1/3。試驗(yàn)開始前停飼24 h。

1.2 試驗(yàn)用水配制方法

試驗(yàn)用水為充分曝氣的自來水，每個(gè)試驗(yàn)處理用水均為10 L。鹽度和堿度分別采用分析純氯化鈉（NaCl）和碳酸氫鈉（NaHCO3）配制。配制時(shí)將氯化鈉和碳酸氫鈉按所需量準(zhǔn)確稱量加入自來水中，試劑溶解后充分混勻，靜置穩(wěn)定24 h后測(cè)定，水體鹽度通過鹽度計(jì)測(cè)定，堿度采用鹽酸甲基橙標(biāo)定法測(cè)定。

1.3 方法

正式試驗(yàn)前預(yù)試驗(yàn)，獲得中華絨螯蟹24 h全部死亡最低鹽堿濃度和96 h全部存活最高鹽堿濃度。鹽、堿單一因素試驗(yàn)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果采用等對(duì)數(shù)間距法均設(shè)置6個(gè)濃度梯度組及1個(gè)對(duì)照組，鹽度梯度分別為20.00、22.97、26.38、30.32、34.81和40.00 g·L-1；堿度梯度分別為60、72、87、104、125和150 mmol·L-1，鹽堿交互雙因素試驗(yàn)濃度采用單獨(dú)作用試驗(yàn)時(shí)前5個(gè)水平質(zhì)量濃度50%，然后按照等水平均勻設(shè)計(jì)表要求設(shè)計(jì)5個(gè)質(zhì)量濃度梯度。每個(gè)濃度梯度設(shè)3個(gè)平行組，每組10只中華絨螯蟹。試驗(yàn)期間水溫保持（21.9±0.2）℃，持續(xù)充氧，每日換水1/3。試驗(yàn)開始后記錄24、48、72和96 h蟹成活數(shù)和活動(dòng)情況，試驗(yàn)過程中死蟹及時(shí)撈出。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 19.0作分析。鹽、堿單獨(dú)作用半致死濃度（LC50）及其95%置信區(qū)間采用寇氏法（Karber氏法）計(jì)算，計(jì)算公式如下：

式中，Xm為最高濃度對(duì)數(shù)；d為濃度對(duì)數(shù)差；Pi為死亡率；n為試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)；SD為標(biāo)準(zhǔn)差。

安全濃度SC參照陳小紅等方法[12]計(jì)算：

鹽堿交互雙因素試驗(yàn)中將鹽度和堿度濃度轉(zhuǎn)換為水中所含溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用SPSS 19.0作二項(xiàng)式回歸分析[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度對(duì)中華絨螯蟹的毒性作用

對(duì)照組中，中華絨螯蟹行為正常，但在鹽度脅迫濃度組中，試驗(yàn)蟹反應(yīng)較強(qiáng)烈，40 g·L-1處理組中毒反應(yīng)強(qiáng)烈，短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)躁動(dòng)不安，游動(dòng)速度加快等中毒現(xiàn)象。隨脅迫時(shí)間增加，蟹游動(dòng)遲緩，出現(xiàn)部分附肢脫落現(xiàn)象，個(gè)別蟹出現(xiàn)腹部上翻，身體僵直。26.38、30.32和34.81 g·L-1處理組蟹出現(xiàn)中毒反應(yīng)時(shí)間稍晚，隨脅迫時(shí)間增加，試驗(yàn)蟹也開始出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、抱團(tuán)、少數(shù)附肢脫落、腹部上翻等中毒現(xiàn)象。20.00和22.97 g·L-1處理組蟹均未表現(xiàn)中毒反應(yīng)。隨鹽度增加，不同處理時(shí)間中華絨螯蟹死亡率逐漸升高（見表1）。經(jīng)計(jì)算，鹽度對(duì)中華絨螯蟹在24、48、72和96 h時(shí)半致死濃度分別為35.24、32.81、31.25和26.55 g·L-1，安全濃度為8.54 g·L-1。

表1 鹽度對(duì)中華絨螯蟹毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Toxicity test results of salinity to Chinese mitten crab

2.2 堿度對(duì)中華絨螯蟹的毒性作用

在堿度脅迫條件下，蟹的行為反應(yīng)與鹽度脅迫一致，但整體出現(xiàn)中毒反應(yīng)時(shí)間較晚。150 mmol·L-1處理組試驗(yàn)蟹在脅迫初期表現(xiàn)亂游現(xiàn)象，隨脅迫時(shí)間增加，蟹體逐漸出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、抱團(tuán)及附肢脫落現(xiàn)象。60和72 mmol·L-1處理組蟹在暴露初期均未出現(xiàn)異常，24 h后，個(gè)別個(gè)體開始逐漸出現(xiàn)游動(dòng)變緩、反應(yīng)遲鈍、死亡等中毒癥狀。經(jīng)計(jì)算，堿度對(duì)中華絨螯蟹在24、48、72和96 h時(shí)半致死濃度分別為110.43、90.50、75.78和69.74 mmol·L-1，安全濃度為18.25 mmol·L-1（見表2）。

2.3 鹽堿交互對(duì)中華絨螯蟹的毒性作用

在鹽堿交互作用條件下，隨鹽堿濃度升高，蟹中毒現(xiàn)象明顯，主要表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)急速游動(dòng)，隨鹽堿暴露時(shí)間增加，行動(dòng)逐漸遲緩，直至大部分蟹體靜臥于試驗(yàn)缸底，部分蟹體出現(xiàn)附肢脫落。鹽堿對(duì)中華絨螯蟹的交互作用結(jié)果見表3，中華絨螯蟹死亡率隨溶液中鹽度、堿度升高和暴露時(shí)間增加而升高。在堿度為62.5 mmol·L-1、鹽度為17.41 g·L-1時(shí)96 h中華絨螯蟹死亡率達(dá)100%。根據(jù)武鵬飛等[13]試驗(yàn)方法分析數(shù)據(jù)獲得脅迫24、48、72和96 h時(shí)中華絨螯蟹死亡率與鹽堿關(guān)系擬合較好（R2＞0.95，P＜0.05）回歸模型：

表3 鹽堿聯(lián)合對(duì)中華絨螯蟹的毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Toxicity test results of salt-alkali combination to Chinese mitten crab

式中，x1和x2分別代表鹽度和堿度，y1、y2、y3、y4分別代表24、48、72和96 h死亡率，由回歸模型分析得出：在所有回歸模型中，鹽度對(duì)死亡率表現(xiàn)為一元一次方程，而堿度對(duì)死亡率表現(xiàn)為一元二次方程。試驗(yàn)期間，鹽度和堿度交互項(xiàng)系數(shù)均為正值，鹽度和堿度對(duì)蟹死亡率表現(xiàn)為協(xié)同作用，表明鹽堿交互條件下毒性作用強(qiáng)于單一鹽度或堿度，在48～96 h協(xié)同系數(shù)逐漸增大，表明鹽度和堿度協(xié)同作用在96 h表現(xiàn)最強(qiáng)，48 h表現(xiàn)最弱。

表2 堿度對(duì)中華絨螯蟹毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Toxicity test results of alkalinity to Chinese mitten crab

3 討論

3.1 中華絨螯蟹對(duì)鹽度的耐受性

水體鹽度在一定程度上直接影響水生動(dòng)物生長(zhǎng)和發(fā)育[14]。一般情況下，水生動(dòng)物主要通過滲透壓調(diào)節(jié)適應(yīng)環(huán)境水體鹽度變化[15]。在鹽度脅迫條件下，水生動(dòng)物主要通過增加鰓中泌氯細(xì)胞數(shù)量和Na+-K+-ATP酶活性調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及物質(zhì)能量代謝，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)外滲透壓動(dòng)態(tài)平衡[16]。不同水生動(dòng)物在鹽度脅迫下表現(xiàn)的滲透壓調(diào)節(jié)能力不同，具體為其鹽度半致死濃度和安全濃度存在差異。本研究中，通過對(duì)比分析半致死濃度和安全濃度表明，中華絨螯蟹對(duì)鹽度耐受能力不僅高于鯉（Cyprinus carpio）[17]、彭澤鯽（Carassius auratusPengze）[18]等普通經(jīng)濟(jì)淡水魚類，也高于凡納濱對(duì)蝦[6]、大鱗鲃[7]等耐鹽堿水產(chǎn)動(dòng)物，但其鹽度耐受能力低于尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[19]。中華絨螯蟹作為廣鹽性高滲透調(diào)節(jié)物種在其繁殖期和幼體發(fā)育期需在淡、海水交界處完成[8]，此時(shí)中華絨螯蟹對(duì)鹽度具有較強(qiáng)滲透壓調(diào)節(jié)能力。隨鹽度進(jìn)一步升高，水體環(huán)境中滲透壓和離子濃度高于血漿時(shí)，中華絨螯蟹必須通過大量攝入高鹽水維持自身血漿滲透壓，當(dāng)機(jī)體無法在短時(shí)間內(nèi)完成“保水排鹽”滲透調(diào)節(jié)時(shí)，機(jī)體內(nèi)大量鹽分無法及時(shí)排出[20]，此時(shí)蟹體滲透壓平衡遭到破壞，機(jī)體代謝功能失調(diào)，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的組織損傷時(shí)，機(jī)體開始死亡。

3.2 中華絨螯蟹對(duì)堿度的耐受性

堿度作為鹽堿水域重要理化因子，對(duì)維持養(yǎng)殖水體pH及離子穩(wěn)態(tài)具有重要意義[21-22]。研究表明，堿性環(huán)境造成水生動(dòng)物鰓組織損傷，改變其能量代謝方式，并可能影響其正常脫殼和生長(zhǎng)[23-25]。中華絨螯蟹在堿性脅迫時(shí)也呈現(xiàn)相似生理反應(yīng)[26-28]。雷衍之等認(rèn)為碳酸鹽堿度對(duì)魚體的影響是通過堿度與pH協(xié)同作用的結(jié)果[29]。在碳酸鹽型鹽堿水環(huán)境中，隨碳酸鹽堿度升高，水體中pH與HCO3-含量也隨之升高，這些離子直接作用于水生動(dòng)物鰓表面上皮細(xì)胞，導(dǎo)致其鰓上皮分離或破裂，氯細(xì)胞增生或肥大，從而影響細(xì)胞表面離子交換體系，同時(shí)，HCO3-也可通過影響血液中二氧化碳平衡系統(tǒng)，從而對(duì)水生動(dòng)物產(chǎn)生危害[29]。魚類由淡水進(jìn)入堿性水體中，魚體組織結(jié)構(gòu)發(fā)生適應(yīng)性改變，但這種改變無法超過魚體耐受極限。雷衍之等在碳酸鹽堿度對(duì)魚類毒性作用的研究中提出，10 mmol·L-1堿度可作為常見淡水魚養(yǎng)殖用水危險(xiǎn)指標(biāo)[29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，中華絨螯蟹堿度安全濃度為18.25 mmol·L-1，明顯高于此數(shù)值。比對(duì)分析表明，中華絨螯蟹堿度半致死濃度高于澎澤鯽[18]、淡水白鯧（Colos soma brachypomum）[30]等高耐堿魚類，且其安全濃度也明顯高于凡納濱對(duì)蝦[6]、羅氏沼蝦[5]、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）[31]等水產(chǎn)動(dòng)物。以上結(jié)果表明，中華絨螯蟹對(duì)碳酸鹽堿度具有較強(qiáng)耐受性。

3.3 中華絨螯蟹對(duì)鹽堿聯(lián)合的耐受性

本試驗(yàn)探究中華絨螯蟹對(duì)鹽堿聯(lián)合毒性耐受能力，結(jié)果表明，鹽度和堿度對(duì)中華絨螯蟹聯(lián)合毒性作用在96 h內(nèi)全部表現(xiàn)為協(xié)同作用，62.5 mmol·L-1碳酸鹽堿度和17.41 g·L-1鹽度聯(lián)合毒性作用使中華絨螯蟹在96 h內(nèi)全部死亡。王桂春在鹽度和堿度對(duì)中華絨螯蟹毒性作用的研究表明中華絨螯蟹在21.02 mmol·L-1碳酸鹽堿度和8 g·L-1鹽度聯(lián)合脅迫96 h時(shí)全部死亡，其測(cè)定結(jié)果低于本試驗(yàn)，這可能與中華絨螯蟹品種、規(guī)格及試驗(yàn)環(huán)境條件不同有關(guān)[32]。另外，與其他水生動(dòng)物相比，中華絨螯蟹在96 h內(nèi)全部死亡的鹽堿濃度高于羅氏沼蝦[5]，略低于達(dá)里湖高原鰍[4]和克氏原鰲蝦[33]。此外，鹽堿聯(lián)合作用于不同水生生物表現(xiàn)出不同聯(lián)合效應(yīng)。例如，鹽堿聯(lián)合對(duì)泥鰍[31]、克氏原螯蝦[23]、達(dá)里湖鯽（Carassius auratus）[33]等毒性作用表現(xiàn)為拮抗作用，即鹽堿聯(lián)合作用毒性比鹽度和堿度單獨(dú)作用毒性總和弱；而對(duì)澎澤鯽[18]和淡水白鯧[30]表現(xiàn)為協(xié)同作用。

鹽堿水對(duì)水生生物的影響是水體pH、鹽度、堿度等多種因素綜合作用結(jié)果，水體Cl-和HCO3-是其中最主要影響因素[2]。目前僅見鹽堿聯(lián)合毒性對(duì)魚類影響的相關(guān)報(bào)道。趙麗慧等研究發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚主要通過離子轉(zhuǎn)運(yùn)與滲透壓調(diào)節(jié)過程響應(yīng)鹽堿脅迫，鰓組織中Na+-K+-ATP酶和碳酸酐酶則作為重要轉(zhuǎn)運(yùn)酶參與上述過程[34]；梁從飛等也探究鹽堿交互作用對(duì)尼羅羅非魚的影響，并認(rèn)為鹽堿混合條件下不同離子間存在協(xié)同作用[35]。參考上述魚類相關(guān)研究結(jié)果，提出中華絨螯蟹被鹽、堿脅迫激活的不同調(diào)節(jié)機(jī)制，并隨時(shí)間增加機(jī)體耗能持續(xù)增加，最終導(dǎo)致能量不足，使鹽堿脅迫對(duì)中華絨螯蟹的毒性作用加劇，這可能是鹽堿聯(lián)合毒性對(duì)中華絨螯蟹表現(xiàn)為協(xié)同作用的主要原因之一。目前，關(guān)于堿度及鹽堿聯(lián)合對(duì)中華絨螯蟹脅迫的研究較少，本文為后續(xù)中華絨螯蟹對(duì)鹽度、堿度以及鹽堿交互脅迫的響應(yīng)機(jī)制等方面提供基礎(chǔ)資料。

4 結(jié)論

本文開展中華絨螯蟹對(duì)鹽度、堿度及鹽堿交互耐受能力研究。結(jié)果表明，中華絨螯蟹在24、48、72和96 h時(shí)氯化鈉（NaCl）鹽度半致死濃度（LC50）分別為35.24、32.81、31.25和26.55 g·L-1，安全濃度為8.54 g·L-1；在24、48、72和96 h的碳酸氫鈉（NaHCO3）堿度半致死濃度（LC50）分別為110.43、90.50、75.78和69.74 mmol·L-1，安全濃度為18.25 mmol·L-1。鹽堿交互作用對(duì)中華絨螯蟹的毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用。中華絨螯蟹對(duì)碳酸鹽型鹽堿水環(huán)境具有較強(qiáng)耐受性，適宜在鹽度低于8.54 g·L-1或碳酸鹽堿度低于18.25 mmol·L-1鹽堿水域開展增養(yǎng)殖。