范明明，韓海瑞，林 偉，張嘉裕，王 順

（1.黑龍江省中醫(yī)藥科學院，哈爾濱 150036；2.黑龍江省中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040）

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）作為消化系統(tǒng)多發(fā)的、常見的疾病，嚴重影響患者生活質(zhì)量。亞洲國家每100 人就有5～30 人患有功能性消化不良，在發(fā)達國家高達10～40 人[1]。羅馬Ⅳ診斷標準[2]在綜合癥狀與進餐關系的基礎上將餐后不適綜合征（PDS）和上腹痛綜合征（EPS）納為功能性消化不良的2 個亞型。功能性消化不良主要表現(xiàn)為上腹部脹痛、早飽感、噯氣、食欲不振、嘔吐等癥狀的臨床綜合征[3-4]。導師根據(jù)多年臨證經(jīng)驗，自擬柴術(shù)理胃飲治療肝郁脾虛型功能性消化不良。為了探討其作用機制，我們研究了該方對功能性消化不良大鼠胃腸運動功能及下丘腦組織中磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶（p-P38MAPK）、核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor NF）-κB p65 蛋白和基因表達的影響。

1 實驗材料

選用60 只黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心的SPF級健康SD 大鼠，6 周齡，雄性，體質(zhì)量（220±20）g，許可證號：SCXK 黑2016004。為保障動物飼養(yǎng)福利，給予健康、充足飲食、飲水，提供清潔、舒適的生活環(huán)境，全過程將嚴格遵循《實驗動物管理與使用指南》中有關規(guī)定執(zhí)行，方案獲得黑龍江省中醫(yī)藥科學院倫理委員會批準。moticam3000 顯微攝影系統(tǒng)，美國motic；雙垂直蛋白電泳儀（DYCZ-24DN）、凝膠成像系統(tǒng)（WD-9413B），北京六一公司；超速冷凍離心機（H-2050R），湖南湘儀公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH36001B），天津泰斯特公司；酶標儀（ELX-800），BIOTEK 公司；熒光定量PCR 儀（ABI7500），Applied Biosystems 公司。柴術(shù)理胃飲（柴胡15 g，白術(shù)15 g，黨參20 g，枳實10 g，白芍15 g，陳皮10 g，姜半夏10 g，丹參10 g，砂仁10 g，炙甘草10 g）：常規(guī)水煎濃縮為10.8 g/mL 后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；用蒸餾水將10 mg/片的多潘立酮（西安楊森公司）制成0.3 mg/mL 的藥液。

2 實驗方法

2.1 動物分組 將大鼠隨機分為6 組，每組10 只，分組遵循隨機數(shù)字表法原則：模型組、柴術(shù)理胃飲低、中、高劑量組和多潘立酮組。其中多潘立酮組為陽性對照組，另設空白組10 只。

2.2 造模方法 采用復合因素方法制備肝郁脾虛型FD 大鼠模型：慢性疲勞、懸尾刺激和飲食失節(jié)[5-7]。

2.3 藥物治療 造模后通過曠場試驗對大鼠進行綜合評價，合格者視為模型制備成功。按照《藥理實驗方法學》根據(jù)體質(zhì)量換算給藥劑量，每天給藥1 次，持續(xù)21 d?？瞻捉M、模型組大鼠給藥劑量按公式計算為10 mL/（kg·d），選用生理鹽水灌胃[8]，柴術(shù)理胃飲組分別給予不同濃度水煎劑灌胃，給藥劑量分別為：13.5、27 和54 g/kg；陽性對照組按3.125 mg/kg 給予多潘立酮水溶液灌胃。

2.4 胃腸動力測定 實驗前，大鼠全部不禁水，同時12 h 內(nèi)禁食，用1 mL/100 g 的碳素墨水給其灌胃。30 min后麻醉，選用1%戊巴比妥鈉，劑量為40 mg/kg，嚴格按照規(guī)范實驗步驟操作，注射部位為大鼠腹腔。先用真空采血管心臟取血，分離血清備用。再分別檢測胃排空率和小腸推進率[9]。胃排空率（%）＝（全胃重－空胃重）/全胃重×100%。小腸推進率（%）＝碳墨在小腸推進的距離/小腸總長度×100%。

2.5 p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白表達 WB 法檢測大鼠下丘腦組織中p-P38MAPK、NF-κB p65蛋白表達。

2.6 p-P38MAPK、NF-κB p65 mRNA 表達 RT-PCR 檢測下丘腦組織中p-P38MAPK、NF-B p65 mRNA 表達。引物序列均在北京Invitrogen 公司合成。引物序列如下：β-actin，F(xiàn)orward：5’-CATCTCTTGGAAGTCCA-3’，Reverse：5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3’，280 bp；p-P38，F(xiàn)orward：5’-CTGGAGGAGTTCAATGACGTG-3’，Reverse：5’-CGGAGGATTTGGTAGATAAGGA-3’，122 bp；NF-κB p 65，F(xiàn)orward：5’-TCTGCCG AGTAAACCGGAAC-3’，Reverse：5’-CAGGCTAGG GTCAGCGTATG-3’，200 bp。

2.7 大鼠下丘腦組織病理形態(tài)學觀察 為研究柴術(shù)理胃飲給藥前后大鼠下丘腦組織的變化，在胃腸動力檢測完成后，將下丘腦組織制成厚度為4 μm 的切片，通過HE 染色觀察其病理學變化。

2.8 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（）表示，應用SPSS 20.0 軟件包進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析，組間比較t檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 大鼠一般狀態(tài) 在造模開始時，各組大鼠的飲水量、食量、體質(zhì)量、糞便和皮毛的色澤等都正常，大鼠神態(tài)安靜且活潑好動，皮毛干凈整齊，兩睛有神。造模后，動物的飲水量逐漸減少且進食量也相應減少，身體輪廓日漸瘦削，糞便質(zhì)稀，眼神無光，皮毛無華且茂密度較前稀，活動度也不如造模前，對周圍環(huán)境變化的應對能力也大為下降。各治療組大鼠經(jīng)過21 d的柴術(shù)理胃飲治療，進食量、飲水基本恢復到造模前水平，糞便、精神、體質(zhì)量和皮毛色澤等方面均恢復至正常水平，但模型組除外。

3.2 各組大鼠進食量和體質(zhì)量的變化 見表1。

表1 各組大鼠造模后和治療后進食量和體質(zhì)量的變化（，n =10）g

表1 各組大鼠造模后和治療后進食量和體質(zhì)量的變化（，n =10）g

注：與正常組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.3 各組大鼠胃腸動力比較 見表2。

表2 各組大鼠胃腸動力比較（，n =10） %

表2 各組大鼠胃腸動力比較（，n =10） %

注：與正常組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.4 各組大鼠下丘腦組織p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白表達 與空白組相比，模型組大鼠下丘腦組織中p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白表達率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，柴術(shù)理胃飲各劑量組和多潘立酮組大鼠下丘腦組織中p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白表達率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1、表3。

圖1 Western blot 法檢測各組下丘腦組織p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白表達

表3 各組下丘腦組織p-p38MAPK、NF-κB p65 蛋白表達（，n =3）

表3 各組下丘腦組織p-p38MAPK、NF-κB p65 蛋白表達（，n =3）

注：與正常組比較，## P ＜0.01，與模型組比較，△△P ＜0.01

3.5 各組大鼠下丘腦組織p-P38MAPK、NF-κB p65 mRNA 表達 與空白組比較，模型組大鼠下丘腦組織p-P38MAPK、NF-κB p65 mRNA 的表達水平上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，柴術(shù)理胃飲各劑量組及多潘立酮組大鼠下丘腦組織p-P38MAPK、NF-κB p65 mRNA 表達水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），見表4。

表4 各組下丘腦組織p-P38MAPK、NF-B p65 mRNA 表達（，n =3）

表4 各組下丘腦組織p-P38MAPK、NF-B p65 mRNA 表達（，n =3）

注：與正常組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.6 各組大鼠胃組織病理學表現(xiàn) 各組大鼠胃竇組織黏膜層和肌層規(guī)整，層次結(jié)構(gòu)完整，相關病理變化不可見；大鼠細胞在各組織層里規(guī)則的排列，空白組無炎性細胞浸潤，柴術(shù)理胃飲各劑量組和模型組胃竇黏膜層均可見淋巴細胞及中性粒細胞浸潤，但柴術(shù)理胃飲組較模型組輕，肌層未見明顯異常。見圖2。

圖2 柴術(shù)理胃飲對各組大鼠胃組織的影響（×100）

4 討論

功能性消化不良在臨床上相當常見，該病是一種功能性胃腸病，在《功能性消化不良中醫(yī)診療專家共識意見（2017）》中，此病屬于中醫(yī)“胃痛”“胃痞”范疇[10]。隨著祖國醫(yī)藥的不斷進步，越來越多的患者尋求中醫(yī)藥治療?！杜R證指南醫(yī)案·卷六·郁》云：“悒郁動肝致病，久則延及脾胃中傷，不納，不知味?！惫蚀俗C多因情志傷肝木，致使肝失于調(diào)達而橫逆犯脾；《素問·痹論》[11]云：“飲食自倍，腸胃乃傷?！惫势剿仫嬍呈Ч?jié)、過于勞倦，致使脾氣受損而失于健運，脾濕漸生郁于肝木，肝木失于疏泄遂成此證[12]。其本在脾胃受損而虛，其標在肝氣不達而郁滯，宜標本兼治，培元固本?；局畏ǘ嗖捎靡鏆饨∑?、解郁疏肝[13]，中藥方選柴術(shù)理胃飲加減。

柴術(shù)理胃飲主治肝郁脾虛證，有疏肝解郁，健脾益氣之功效。整方組成為柴胡、白術(shù)、黨參、枳實、白芍、陳皮、姜半夏、丹參、砂仁、炙甘草。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》[14]載：“柴胡，味苦平。主心腹，去腸胃中結(jié)氣，飲食積聚……輕身明目益精?！蔽缎?、苦，性微寒，歸肝膽肺經(jīng)，能疏肝解郁，使肝氣調(diào)達，《滇南本草》[15]云：“行肝經(jīng)逆結(jié)之氣，止左脅肝氣疼痛”，白術(shù)性溫，味甘、苦，歸脾胃經(jīng)，擅補氣健脾，可助脾運化，以資氣血生化之源，二者共為君藥。黨參味甘，性平，歸脾、肺經(jīng)，擅補中益氣，健脾益肺，養(yǎng)血生津，與白術(shù)相伍[16]，既可健補脾胃之氣，亦能助運化，主治脾胃氣虛之癥；枳實、陳皮理氣行滯而和胃，陳皮以升為主，上提郁滯諸氣，枳實以降為要，下沉上滯之氣，升降相因相用，以疏肝理脾；白芍與柴胡相伍[17]，既得芍之養(yǎng)血柔肝、斂陰止汗，兼具緩急止痛功效，白芍得柴胡，養(yǎng)陰氣機不滯，故而又不失利肝之用，養(yǎng)肝之體，俱為臣藥。半夏、砂仁和胃燥濕，益氣和胃，行氣化滯；丹參味苦微寒，歸心肝經(jīng)，活血祛瘀、通經(jīng)止痛；甘草調(diào)和藥性，與白芍相合，增緩急止痛之功，俱為佐使藥。

胃腸道運動功能障礙是功能性消化不良較為重要的發(fā)病機制之一，主要包括餐后胃運動障礙，胃排空延遲，餐后食物分布異常，胃肌電異常等[18]。p38MAPK信號通路是MAPK家族的重要組成部分[19]，激活后轉(zhuǎn)移至細胞核。體外和體內(nèi)研究表明，100 多種蛋白質(zhì)易受 p38 MAPK 的直接磷酸化，其中約一半是轉(zhuǎn)錄因子，其余的底物包括蛋白激酶、磷酸酶、凋亡調(diào)節(jié)因子、生長因子受體和細胞骨架蛋白等。這些底物及其下游靶點介導p38 信號在炎癥、細胞周期調(diào)節(jié)、增殖、存活和死亡等多種細胞過程中的功能[20]。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)免疫應答、炎癥反應等。在胃腸系統(tǒng)中，一方面NF-κB 活性與胃潰瘍、克羅恩病等疾病的發(fā)病有關，另一方面NF-κB 可以促進受損腸上皮再生，防止輻射誘導的腸上皮壞死和腸損傷[21]。課題組在實驗中發(fā)現(xiàn)，功能性消化不良大鼠的下丘腦組織中的p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白和基因表達量發(fā)生異常改變，故而從該角度探討其與功能性消化不良發(fā)生發(fā)展的相關性。

本實驗結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠下丘腦組織中的p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白和基因表達量增多；柴術(shù)理胃飲不同劑量組能不同程度地降低大鼠下丘腦組織中p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白和基因表達量，其藥理作用呈量效關系。

本研究結(jié)果表明，柴術(shù)理胃飲可以改善肝郁脾虛型功能性消化不良大鼠的胃排空功能、促進小腸推進功能、降低大鼠下丘腦組織中p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白和基因表達量等作用，這可能是其治療功能性消化不良的作用機制之一。