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        半夏生物總堿對癲癇大鼠行為學、腦組織病理學及BDNF/Trk-B 表達的影響

        2022-01-24 12:10:14鄧楚欣于征淼林培政吳智兵
        吉林中醫(yī)藥 2021年12期
        關鍵詞:總堿托吡酯半夏

        鄧楚欣,于征淼,林培政,吳智兵*

        (1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腦病中心腦病科,廣州 510000;2.廣州中醫(yī)藥大學溫病教研室,廣州 510000)

        癲癇是一組病因及臨床表現(xiàn)復雜的疾病,其標志性癥狀為自發(fā)癇性發(fā)作(spontaneous recurrent seizure,SRS);隨著癲癇病理機制(epileptogenesis)的發(fā)展,常合并行為、認知及精神方面的功能障礙。癲癇長期管理的發(fā)展目標涵蓋3 個方面:控制癇性發(fā)作、改善癲癇合并癥、抑制或逆轉腦組織病損?,F(xiàn)存的抗癇藥(anti-epileptic drugs,AEDs)能有效控制癇性發(fā)作,但難以改善癲癇慢性病程[1-2]。半夏為天南星科多年生草本半夏的干燥塊莖,在中醫(yī)臨床中常用于治療以頑痰為本的癇病。半夏生物總堿(pinellia total alkaloids,PTA)可能是治療癲癇的活性成分之一[3-4]。本研究用匹羅卡品(pilocarpine,PILO)建立大鼠癲癇模型[5],以托吡酯為對照,評價半夏生物總堿對空間工作記憶能力、自主活動量、海馬結構神經元的形態(tài)及數量、齒狀回(dentate gyrus,DG)苔蘚纖維發(fā)芽(Mossy fiber sprouting,MFS)現(xiàn)象以及腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和絡氨酸蛋白激酶受體B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)蛋白表達量的影響。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料 SPF 級4~5 周齡雄性SD 大鼠92只,飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院SPF 級動物實驗室 [SYXK(粵)2013-0092],可自由取食,適應性飼養(yǎng)7 d 后體質量為(213.0 ± 12.03)g。半夏生物總堿(南京道斯夫,批號170325R)、托吡酯(大連美侖,批號F0601A)、PILO(Sigma-Aldrich,批號MKBW5175V)、氯化鋰(LiCl)(Sigma-Aldrich,批號SLBP9949V)、甲基溴化東莨菪堿(methscopolamine bromide,MSB)(上海阿拉丁,批號E1529108)和水合氯醛(天津大茂,批號20160905)分別溶于生理鹽水(normal saline,NS)(四川科倫,批號A17020606-1)。5%葡萄糖氯化鈉注射液(glucose solution 加NS,GS 加NS)(四川科倫,批號A16070305-2)。

        1.2 行為學測試 Y 臂迷宮用于強迫路線轉換測試(forced alternation test,F(xiàn)AT)和自發(fā)路線轉換測試(spontaneous alternation test,SAT),有3 條外觀一致、互相呈120°的臂;曠場活動(open field locomotion,OFL)箱長90 cm、寬90 cm、高50 cm。適應性飼養(yǎng)結束后進行第1 次行為學測試,治療結束后進行第2 次行為學測試。FAT 采集“目標臂停留時間”和“強迫路線轉換行為(forced alternation behavior,F(xiàn)AB)”,計算FAB%=(組內正確選擇目標臂的大鼠只數/組內大鼠只數)×100%;SAT 采集“自發(fā)路線轉換行為(spontaneous alternation behavior,SAB)”,計算SAB%={SAB 次數/(總進入臂次數-2)}×100%;OFL 采集“進入格數”和“中心停留時間”[6-8]。

        1.3 分組、造模、給藥及取材 第1 次行為學測試后,92 只大鼠隨機分為正常對照組18 只,模型組74 只。首先腹腔注射(intraperitoneal injection,ip)LiCl(127 mg/kg),17.5 h 后予MSB(1 mg/kg,ip);再0.5 h后,模型組予PILO(30 mg/kg,ip),正常對照組予等量NS ip。首劑PILO 注射30 min 后如大鼠未進入癲癇持續(xù)狀態(tài)(Status epilepticus,SE),追加1次PILO(10 mg/kg),最多追加4 次。SE 持續(xù)90 min 為造模成功,隨后予7%水合氯醛(350 mg/kg,ip)終止發(fā)作,正常對照組在相應時點執(zhí)行,水合氯醛注射20 min 后如發(fā)作仍未完全停止可追加1 次(87.5 mg/kg,ip)。自癲癇持續(xù)狀態(tài)當天起,全部大鼠連續(xù)5 d 予GS 加NS(4 mL,ip)。按Racine 分級界定癇性發(fā)作級別,按Brandt 等的方案界定癲癇持續(xù)狀態(tài)[9-10]。在癲癇持續(xù)狀態(tài)后第6 天仍存活者再隨機分為癲癇對照組(NS,n=13)、托吡酯組(0.06 g/kg,n=12)、PTA 低劑量組(0.4 g/kg,n=10)和PTA 高劑量組(0.8 g/kg,n=12)。以上4組與正常對照組(NS,n=17)每天灌胃1次,連續(xù)14 d。第2 次行為學測試后,一部分大鼠留取新鮮腦組織后置于液氮保存,一部分大鼠經4%多聚甲醛溶液(北京雷根,批號0313A17)行心臟灌流后留取固定腦組織。

        1.4 病理染色 完成Nissl 染色(碧云天生物,批號042717170702)和Timm 染色(上海哈靈,批號20171124HL)后在顯微鏡(Olympus,型號IX3-RFACS)下拍照。Nissl 染色:在400 倍光鏡下,在DG 顆粒細胞層、CA3 區(qū)和CA1 區(qū)分別選3 個連續(xù)視野拍攝,在齒狀回門區(qū)(dentate hilus,DH)選2 個連續(xù)視野拍攝;用Image J 軟件測量顆粒細胞層在視野中的面積占比;在CA3 區(qū)及CA1 區(qū)計數錐體細胞,在DH 計數多形細胞。Timm 染色:在400 倍光鏡下的DG 顆粒細胞層及內側分子層交界處選4 個連續(xù)視野拍攝;用Image J 軟件將圖像轉換為8-bit,校正光密度后測量內側分子層中MFS 的平均光密度。

        1.5 Western-blot 法檢測 在液氮中研磨新鮮海馬結構組織后加入RIPA 裂解液(Thermo,批號SF249254),經離心(4 ℃,12 000 r/min,10 min)后留取上清并行蛋白定量(Bio-world,BCA 定量試劑盒,批 號9802334)。取500 μL 樣 品 混合125 μL loading buffer 后加熱(70 ℃,10 min)。向每孔加樣后用電泳儀(Bio-rad,型號1645052)跑膠:SDS-PAGE 濃縮膠(5%)恒壓80 V-20 min,分離膠(15%,8%)120 V-1 h。轉 膜:BDNF 用0.4A 恒 流 轉45 min;Trk-B 用0.4A 恒流轉1 h。取膜后用5%脫脂牛奶在常溫封閉1 h 后,加入一抗在4 ℃孵育過夜,其中BDNF(1:1 000;北京博奧森,批號AH02263758)、Trk-B(1:5 000;上海艾博抗,批號GR308211-2)和β-actin(1:5 000;北京博奧森,批號AH01032107)。洗膜。隨后用帶有熒光素標記的二抗在常溫下孵1 h,洗膜。將條帶放到熒光成像系統(tǒng)(Odyssey Fc-LI-COR 顯色儀)中顯影及拍攝,用Image J 軟件分析條帶。

        1.6 統(tǒng)計學方法 計量資料以均數±標準差()表示,組內比較采用配對t檢驗;組間比較呈正態(tài)分布者進行單因素方差分析,方差齊時采用LSD 法,方差不齊時采用Games-Howell 檢驗;非正態(tài)分布者進行Kruskal-Wallis 檢驗。計數資料組間比較用χ2檢驗。

        2 結果

        2.1 半夏生物總堿對空間工作記憶能力及自主活動量的影響 見表1、表2。第2 次測試時,正常對照組FAB%為94.12%(16/17),與之比較,癲癇對照組(75%,9/12)、PTA 高劑量組(66.67%,8/12)、PTA 低劑量組(50%,5/10)和托吡酯組(50%,5/10)的FAB%較低(各P<0.05)。

        表1 PTA 對FAT-目標臂停留時間的影響()

        表1 PTA 對FAT-目標臂停留時間的影響()

        注:第1 次測試時PTA 低劑量組和第2 次測試時癲癇對照組分別剔除1 只大鼠。同一行,與第1 次測試比較,# P <0.05,## P <0.01

        表2 5 組大鼠第2 次行為學測試指標組間比較()

        表2 5 組大鼠第2 次行為學測試指標組間比較()

        注:同一列,與正常對照組比較,# P <0.05,## P <0.01,### P <0.001;與托吡酯組比較,△△P <0.01

        2.2 半夏生物總堿對海馬結構組織形態(tài)學病變的影響 見表3、圖1。與正常對照組比較,癲癇對照組CA3 區(qū)、CA1 區(qū)及DH 的神經元數量顯著減少,形態(tài)腫脹、排列紊亂,Nissl 小體減少;DG 見層狀分布的、深染色的苔蘚纖維發(fā)芽,在局部交織成片或深入內側分子層。

        圖1 PTA 對海馬結構組織形態(tài)學病變的影響(×400)

        表3 PTA 對海馬結構組織形態(tài)學病變的影響()

        表3 PTA 對海馬結構組織形態(tài)學病變的影響()

        注:同一列,與正常對照組比較,# P <0.05,## P <0.01,### P <0.001;與癲癇對照組比較,△P <0.05,△△P <0.01;與托吡酯組比較,▲▲▲P <0.001;與PTA 低劑量組比較,□□P <0.01

        2.3 半夏生物總堿對海馬結構BDNF 及Trk-B 蛋白表達量的影響 見表4、圖2。

        圖2 PTA 對海馬結構mBDNF、proBDNF 及Trk-B 蛋白表達量的影響

        表4 PTA 對海馬結構mBDNF、proBDNF 及Trk-B 蛋白表達量的影響(,n =5)

        表4 PTA 對海馬結構mBDNF、proBDNF 及Trk-B 蛋白表達量的影響(,n =5)

        注:同一列,與正常對照組比較,# P <0.05,## P <0.01

        3 討論

        癲癇大鼠OFL“進入格數”顯著增加反映過度活動,F(xiàn)AB%及SAB%顯著降低反映空間工作記憶障礙,F(xiàn)AT“目標臂停留時間”縮短和OFL“中心停留時間”延長反映對陌生環(huán)境的適應能力下降。半夏生物總堿及托吡酯對過度活動的改善不顯著,但半夏生物總堿0.4 g/kg 可在一定程度上提高SAB%、縮短“中心停留時間”,而半夏生物總堿 0.8 g/kg 可延長“目標臂停留時間”。典型的海馬硬化表現(xiàn)為CA3 區(qū)、CA1 區(qū)和DH 的神經元減損,而DG 和CA2 區(qū)的神經元相對保留[11]。正常的苔蘚纖維從DG 的顆粒細胞發(fā)出,連接DH的苔蘚細胞和海馬CA3區(qū)及CA1區(qū)的錐體細胞。在癲癇大腦中,DG 顆粒細胞的神經新生異常活躍,長出形態(tài)、分布及功能異常的苔蘚纖維,形成異常投射環(huán)路,即所謂苔蘚纖維發(fā)芽現(xiàn)象[12]。以上2 種病變易化癇性放電的產生及傳遞,并與癲癇合并癥發(fā)病有關。半夏生物總堿 0.8 g/kg 對CA3 區(qū)及DH 的神經元減損存在顯著的保護作用,而半夏生物總堿 0.4 g/kg及0.8 g/kg 和托吡酯均對苔蘚纖維發(fā)芽存在顯著的抑制作用。哺乳類動物的大腦中有兩種BDNF 異構體,即proBDNF 及由其裂解而成的mBDNF。mBDNF 的受體為Trk-B,功能與神經元存活、突觸可塑性和記憶功能有關。BDNF 和Trk-B 可通過以下機制加重癲癇病情:BDNF 結合Trk-B 后提高海馬結構的興奮性并促進DG神經新生;BDNF 增強谷氨酸能傳導、下調K+-Cl-同向轉運體功能、直接抑制γ-氨基丁酸受體介導的抑制性突觸后電流,即弱化γ-氨基丁酸能系統(tǒng)功能[13-14]。半夏生物總堿及托吡酯顯著降低mBDNF 的蛋白表達量,而半夏生物總堿對proBDNF 和Trk-B 的蛋白表達量也可能存在降低作用。

        綜上所述,半夏生物總堿對PILO 癲癇模型存在治療作用,表現(xiàn)為改善空間工作記憶障礙、顯著抑制海馬硬化和苔蘚纖維發(fā)芽現(xiàn)象及顯著降低海馬結構中mBDNF 的蛋白表達量;半夏生物總堿還可能降低海馬結構中proBDNF 和Trk-B 的蛋白表達量。

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