余 震，柳 洲,2

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽550004；2.上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海201318)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMS)是一種慢性、難治性疾病，好發(fā)于育齡期女性，其主要特征是盆腔粘連，它與內(nèi)異癥相關(guān)疼痛、不孕及復(fù)發(fā)等密切相關(guān)。80%以上患者在初次手術(shù)時即發(fā)現(xiàn)有盆腔粘連，術(shù)后3個月再粘連發(fā)生率可達50%[1]。EMS的發(fā)病機制尚未明確，近年來研究發(fā)現(xiàn)EMS患者體內(nèi)存在廣泛的細(xì)胞免疫、體液免疫功能紊亂[2]，主要表現(xiàn)為免疫細(xì)胞表達異常，如：巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞，免疫細(xì)胞隨著內(nèi)膜細(xì)胞種植在盆腔中并擴散引起炎癥反應(yīng)[3-4]。有研究顯示[5-6]，消瘤方中可上調(diào)機體CD3+、CD4+/CD8+比值及NK細(xì)胞水平，調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群細(xì)胞的數(shù)量活性，改善體內(nèi)細(xì)胞免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子在免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，EMS患者腹腔及血清中有高水平的炎癥因子[7-8],其水平與炎癥程度成正相關(guān)[9]，手術(shù)切除內(nèi)異癥病灶后相關(guān)炎癥因子水平顯著降低[10]。本實驗通過觀察經(jīng)消瘤方處理后大鼠血清及粘連組織中炎性因子和粘連因子等水平變化，探討消瘤方對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥盆腔粘連的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物：SPF級SD雌性大鼠40只，6～8周齡，體重(200±20)g。由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK(滬)2008-0006。

1.1.2 藥物：中藥消瘤方主要成分為炙鱉甲、鹿角片、水蛭、蟲、莪術(shù)、木饅頭、石見穿、菝葜、黨參、炮姜等，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥制劑室提供。制成濃度0.5 g/ml生藥，用藥量根據(jù)人和大鼠體表面積計算，低劑量組為人等效劑量，翻倍為高劑量組；米非司酮(25 mg/粒)，浙江仙琚制藥股份有限公司(批號:H10950347)；戊酸雌二醇(1 mg/粒)，DELPHARM Lille S.A.S.(批號：H2016067)。

1.1.3 試劑與儀器：水合氯醛，國藥集團化學(xué)試劑有限公司(批號：20210121)；酶聯(lián)免疫吸附試劑盒、免疫組化染色試劑盒，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。光學(xué)顯微鏡，日本Olympus產(chǎn)品。Image-Plus Pro 6.0圖像分析軟件，美國Media Cybernetics公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠EMS模型制備：參考Haber造模方法，采用自體移植法建造大鼠子宮內(nèi)膜異位癥動物模型：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，稱重，10%水合氯醛0.38 ml/100 g腹腔注射，腹部備皮，固定置于超凈臺，碘伏消毒手術(shù)區(qū)域，在尿道口上約1 cm處靠右側(cè)做平行于腹部正中線長約1.5 cm的縱切口進腹，在膀胱背側(cè)找到子宮，挑出右側(cè)子宮，截取長度約2 cm子宮，兩端結(jié)扎后切除子宮段，立即放入盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，縱向剖開，修剪為0.5 cm×0.5 cm大小的碎片共4片，內(nèi)膜面朝向腸系膜，6-0線縫合于腸系膜血管豐富處，檢查無腹腔出血后，逐層關(guān)閉腹腔。

術(shù)后予以戊酸雌二醇[0.105 mg/(kg·d)]混懸液灌胃，每4 d 1次，共3次。4周后隨機挑選8只大鼠開腹觀察，見移植物內(nèi)出現(xiàn)液體積聚(積液高度>2 mm)，呈隆起透亮小囊泡，被結(jié)締組織或大網(wǎng)膜覆蓋并有血管形成，清晰可見，通常與周圍組織聯(lián)系緊密，視為造模成功。

1.2.2 模型動物分組及給藥方法：將40只大鼠隨機分為四組，每組10只成模大鼠，按照人與大鼠體表面積換算法計算米非司酮、消瘤方劑量，所得消瘤方劑量視為低劑量，高劑量組劑量加倍。對照組(生理鹽水組)、米非司酮組[米非司酮混懸液1.05 mg/(kg·d)]、低劑量消瘤方組[1.89 g/(kg·d)]、高劑量消瘤方組[3.78 g/(kg·d)]，每組大鼠每天灌胃1次，每次2 ml，連續(xù)灌胃4周。

1.2.3 盆腔粘連評分：各組相應(yīng)處理后，麻醉大鼠開腹。每只大鼠均采用兩種盆腔粘連評分方法：美國生殖醫(yī)學(xué)會粘連分級(AFS)、Haber粘連評分。

1.2.4 收集標(biāo)本：取腹主動脈血，3000 r/min離心15 min，取血清保存于-80 ℃冰箱。游標(biāo)卡尺測量異位結(jié)節(jié)大小，根據(jù)公式體積(mm3)=0.52×長×寬×高，留取異位結(jié)節(jié)，置于10%中性甲醛溶液中固定，常溫固定24 h后常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片。

1.2.5 免疫組化法檢測異位內(nèi)膜組織VEGF、TNF-α、ICAM1蛋白表達情況：取異位內(nèi)膜組織石蠟病理切片，切片經(jīng)預(yù)處理后滴加一抗(兔抗鼠VEGF、TNF-α、ICAM1)4 ℃，次日滴加二抗，蘇木精復(fù)染，封片。光學(xué)顯微鏡下觀測VEGF、TNF-α、ICAM1蛋白表達情況，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，每張切片連續(xù)選取5個低倍鏡(×200)視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，取其平均值，采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟計算細(xì)胞陽性百分比。陽性細(xì)胞百分比=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 免疫組化法計數(shù)微血管密度(Microvessel density，MVD)：采用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(Strep avidin-biotin complex，SABC)法測定，以兔抗鼠CD34多克隆抗體染色的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞參照Weidner微血管計數(shù)方法，在低倍鏡視野(10倍)下選取最大3個數(shù)值的平均數(shù)作為該例的MVD。

1.2.7 細(xì)胞因子水平檢測：操作方法參照ELISA試劑盒說明書，利用酶標(biāo)儀得到吸光度OD值，再運用CVXPT32軟件包計算出濃度值，得到大鼠血清VEGF、TNF-α、ICAM1及相關(guān)炎性因子IL-6、IL-15、IL-18的濃度。采取粘連處腹膜，進行組織勻漿，ELISA法檢測tPA含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以O(shè)ne-Way ANOVA方式進行方差分析，兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠盆腔粘連評分、異位病灶體積比較 見表1。與對照組相比，低、高劑量消瘤方組、米非司酮組盆腔粘連評分明顯降低(P<0.05);與低劑量消瘤方組比較，高劑量消瘤方組和米非司酮組和盆腔粘連評分均明顯降低(P<0.05)；米非司酮組和高劑量消瘤方組盆腔粘連評分比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。與對照組相比，低、高劑量消瘤方組、米非司酮組病灶體積均明顯較小(P<0.05)；與低劑量消瘤方組相比，高劑量消瘤方組和米非司酮組病灶體積明顯較小(P<0.05)；高劑量消瘤方組和米非司酮組病灶體積比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠盆腔粘連評分、異位病灶體積比較

2.2 消瘤方對內(nèi)異癥病灶種植及生長情況的影響 剖腹觀察可見，對照組異位內(nèi)膜組織生長良好，呈隆起透亮的小囊，囊泡表面可明顯血管，腸管見粘連緊密；中藥低劑量組異位病灶體積較對照組明顯小，血管不明顯，可見腸管見粘連；米非司酮組及中藥高劑量組異位內(nèi)膜組織明顯萎縮，或僅剩殘余痕跡，周圍可見膜狀粘連組織，未見明顯血管。

2.3 消瘤方對內(nèi)異癥大鼠模型異位病灶tPA活性及MVD影響 見表2。與對照組相比，藥物處理后各組異位病灶tPA活性、MVD明顯下降(P<0.05)；與低劑量消瘤方組相比，米非司酮組及高劑量消瘤方組異位病灶tPA活性、MVD顯著下降(P<0.05)；米非司酮組及高劑量消瘤方組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表2 消瘤方對內(nèi)異癥大鼠粘連組織tPA活性及MVD影響

2.4 各組大鼠血清VEGF、TNF-α、ICAM1、IL-6、IL-15、IL-18含量測定比較 見表3。與對照組相比，藥物處理后各組血清中各細(xì)胞因子水平均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；與低劑量消瘤方組相比較，米非司酮組和高劑量消瘤方組血清中各細(xì)胞因子水平有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；米非司酮組和高劑量消瘤方血清中各細(xì)胞因子水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表3 各組大鼠血清VEGF、TNF-α、ICAM1、IL-6、IL-15、IL-18含量測定比較(ng/L)

2.5 各組大鼠異位組織 VEGF、TNF-α、ICAM1蛋白表達比較 見表4。與對照組相比，藥物處理后各組異位組織VEGF、TNF-α、ICAM1蛋白表達均有不同程度下降(P<0.05)；與低劑量消瘤方相比，米非司酮組和高劑量消瘤方組VEGF、TNF-α、ICAM1蛋白表達明顯降低(P<0.05)；米非司酮組和高劑量消瘤方組各組蛋白表達比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表4 各組大鼠異位組織 VEGF、TNF-α、ICAM1蛋白表達比較(%)

3 討 論

盆腔粘連形成是EMS的重要特征，輕度內(nèi)異癥往往表現(xiàn)為亞臨床腹膜炎或輕度盆腔粘連，隨著病變進展，盆腔粘連程度增加，重度EMS往往合并嚴(yán)重而廣泛的粘連[11]。機體異常的免疫狀態(tài)對異位內(nèi)膜的種植、黏附、增生具有直接或間接的作用，腹腔內(nèi)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞可通過促進巨噬細(xì)胞的活化和再生，從而促進細(xì)胞因子和趨化因子的合成和分泌，例如白介素、血管內(nèi)皮生長因子、TNF-α、ICAM1等，導(dǎo)致盆腔粘連及纖維化形成[12]。

研究證實IL-6、IL-15、IL-18等促炎因子在內(nèi)異癥患者血清中含量均有所改變[13]，IL-6可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，促進異位內(nèi)膜的存活，并可協(xié)同LIF促進VFGF的分泌，增強血管生成和組織侵襲[14]；IL-15可促進NK細(xì)胞活化，誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子產(chǎn)生[15]；IL-18可通過刺激T細(xì)胞增殖，增強NK細(xì)胞活性，從而增強免疫細(xì)胞對異位內(nèi)膜的清除能力，內(nèi)異癥患者血清中IL-18的水平下降，免疫功能紊亂，利于內(nèi)膜組織免疫逃逸種植于腹腔[16]。

血管生成是EMS發(fā)生發(fā)展的重要步驟，VEGF是最有效的血管生成介質(zhì)，研究表明VEGF在內(nèi)異灶發(fā)病過程中起重要作用，且VEGF濃度與血管密度顯著相關(guān)[17]。TNF-α由活化的巨噬細(xì)胞分泌，能促進子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞生長和IL-6、IL-8、VEGF及TNF-α自身分泌，并與IL-6協(xié)同促進黏附分子ICAM等基因表達增強，增加內(nèi)皮通透性，促進細(xì)胞-細(xì)胞外的黏附，引起炎癥反應(yīng)[14]。

ICAM1是整合素黏附蛋白家族成員，在子宮內(nèi)膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞等多種細(xì)胞表面表達，參與炎癥和免疫反應(yīng)，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞遷移至炎癥部位[18]。有研究報道，模型ICAM1裂解后的可溶性片段可抑制T細(xì)胞與異位內(nèi)膜細(xì)胞結(jié)合，從而阻止異位內(nèi)膜細(xì)胞的清除[19]。

中醫(yī)認(rèn)為腎虛血瘀為子宮內(nèi)膜異位癥的基本病機，其治療關(guān)鍵為活血化瘀，扶正祛邪，有研究表明活血化瘀藥可減輕內(nèi)異癥患者局部炎癥反應(yīng)，提高子宮內(nèi)膜容受性從而提高患者妊娠率[20]。消瘤方以“腎虛為本，血瘀為表，痰瘀互結(jié)”的補腎活血法，通過辨證施治，達到整體調(diào)節(jié)，標(biāo)本兼治。本研究結(jié)果顯示：藥物處理后的異位病灶較對照組顯著縮小，盆腔粘連明顯減輕；異位病灶粘連組織 tPA活性、MVD下降，且高劑量消瘤方組和米非司酮組效果優(yōu)于低劑量消瘤方組；血清中IL-6、IL-15、VEGF、TNF-α、ICAM1含量，異位組織VEGF、TNF-α、ICAM1蛋白表達經(jīng)藥物處理后較對照組均有所降低，血清中IL-18濃度升高，其中高劑量消瘤方組和米非司酮組變化較低劑量消瘤方組更為明顯。由此可見，消瘤方可通過改善機體免疫功能，調(diào)節(jié)炎性因子及粘連因子水平，抑制管新生成，顯著縮小異位病灶體積，從而減輕內(nèi)異癥盆腔粘連。