任利兵，賈如江，蘇春永，楊曉光，秦景云

（邯鄲市中心醫(yī)院 胸外科，河北 邯鄲056001）

食管癌發(fā)生在食管上皮組織，是消化道常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率均較高，對(duì)人們生命和健康造成嚴(yán)重危害。我國是食管癌發(fā)病和死亡人數(shù)最多的國家，目前治療手段以手術(shù)切除為主，5年內(nèi)存活率低于30%[1]。食管癌的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移過程極其復(fù)雜，其中涉及到多個(gè)基因調(diào)控異常，癌細(xì)胞的侵襲和遷移是食管癌預(yù)后差的主要原因之一[2]。促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體（erythropoietin produces hepatocyte receptor, Eph）家族是一類酪氨酸蛋白激酶受體，在腫瘤細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)信號(hào)通路中起關(guān)鍵調(diào)控作用，EphA2 是Eph 家族最早發(fā)現(xiàn)的成員，廣泛表達(dá)于上皮來源的細(xì)胞，參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程[3]。研究表明，EphA2 在乳腺癌、胃癌、前列腺癌等多種腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)異常升高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性表型行為。高活性的EphA2 與腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal-transition, EMT）密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT 后更易發(fā)生侵襲和遷移，是早期誘發(fā)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4-5]。EphA2在食管癌細(xì)胞中參與細(xì)胞侵襲和遷移機(jī)制研究尚少，本研究在RNA 干擾條件下，探討EphA2 對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響，以期為食管癌的治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人食管癌EC9706 細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.1.2 主要試劑和儀器 RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素（美國Gibco 公司），Brd U（美國Sigma 公司），含有EphA2 干擾序列（EphA2-siRNA）、無義隨機(jī)干擾序列（siRNA-NC）的PGCsi3.0質(zhì)粒（中國吉?jiǎng)P基因公司），LipofectamineTM2000 試劑盒（美國Invitrogen 公司），Transwell 細(xì)胞培養(yǎng)小室（美國Corning 公司），兔抗人EphA2 單抗、Wnt1 多抗、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）單抗、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）單抗、波形蛋白（Vimentin）單抗、山羊抗兔IgG-HRP（美國Abcam 公司），PowerPac 系列電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人食管癌EC9706 細(xì)胞復(fù)蘇后，置于含有10% FBS、100 u/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，于5%的二氧化碳培養(yǎng)箱，37℃恒溫培養(yǎng)，2～3 d 傳代1 次。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將EC9706 細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、空載組及沉默組。轉(zhuǎn)染前24 h，將細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于6 孔板，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁良好，融合80%左右時(shí)按照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前4 h，將培養(yǎng)基更換為不含F(xiàn)BS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基，取4 μg 質(zhì)粒（EphA2-siRNA-PGCsi3.0、siRNA-NC-PGCsi3.0） 和10 μL 脂質(zhì)體，用250 μL 不含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)基分別進(jìn)行稀釋，5 min 內(nèi)將稀釋后的質(zhì)粒和脂質(zhì)體混勻，分別將稀釋后的EphA2-siRNA-PGCsi3.0、siRNANC-PGCsi3.0 復(fù)合物加入空載組、沉默組細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞只加入不含質(zhì)粒的LipofectamineTM2000，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)6 h，然后更換為含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h 后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，均≥80%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Brd U法檢測細(xì)胞增殖能力 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞，按3×104個(gè)/mL 密度接種于24 孔板，內(nèi)附無菌圓玻片，細(xì)胞貼壁后，更換含有10 μmol/L的10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，使用4%多聚甲醛4℃條件下固定過夜，PBS 洗滌×3 次，甲醇固定3 min，加入甲酰胺100℃，5 min 核酸變性，10%山羊血清封閉，加入1∶100 抗小鼠Brd U 單抗（陰性對(duì)照加PBS）4℃孵育過夜，加入熒光抗體Cy3（1∶100）室溫避光孵育2 h，DAPI 染色，封片，顯微鏡下觀察拍照，每組隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算Brd U 陽性率，Brd U 陽性率=Brd U 陽性細(xì)胞數(shù)（紅色）/DAPI 陽性細(xì)胞數(shù)（藍(lán)色）×100%。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔接種于6 孔板，待各組細(xì)胞單層生長鋪滿板底時(shí)，用無菌的200 μL 移液槍頭垂直于培養(yǎng)板，在其底部劃一字型劃痕，用PBS洗去劃下的細(xì)胞，顯微鏡下觀察拍照（0 h），培養(yǎng)24 h 后，觀察各組細(xì)胞劃痕愈合情況并拍照，計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率。劃痕愈合率=（0 h 劃痕距離-24 h劃痕距離）/0 h 劃痕距離×100%。

1.2.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 用不含F(xiàn)BS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基按1∶2 對(duì)Matrige1 基質(zhì)膠進(jìn)行稀釋，放入培養(yǎng)箱靜置2 h，取10 μL 的Matrigel 膠鋪在Transwell 小室上室，將細(xì)胞重懸，調(diào)整密度為2×105個(gè)/ml，取200 μL 細(xì)胞懸液接種于Transwell 小室上室，下室加入600 μL 含10% FBS的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出小室，擦去上室多余細(xì)胞，每孔加入1 mL 多聚甲醛固定30 min，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗滌細(xì)胞后，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞穿膜情況，并拍照計(jì)數(shù)，每組細(xì)胞重復(fù)計(jì)數(shù)3 次，取平均值。

1.2.6 qRT-PCR檢測細(xì)胞中EphA2、Wnt1、βcatenin、E-cadherin、Vimentin mRNA相對(duì)表達(dá)量 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞，Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行核酸定量，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄cDNA，取5 μL 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物A 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，模板cDNA 2 μL，正反向引物各1 μL，加雙蒸水至總體積20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)。每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。以β-actin為內(nèi)參。引物由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算EphA2、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.7 Western blotting 檢測細(xì)胞中EphA2、Wnt1、βcatenin、E-cadherin、Vimentin 蛋白相對(duì)表達(dá)量 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞，加入RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清液，BCA 法測定蛋白濃度，校正上樣量，加入上樣緩沖液，100℃水浴5 min 蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，TBS 洗膜，5%脫脂牛奶封閉2 h 后TBS洗 膜，加入稀釋的EphA2、Wnt1、β -catenin、Ecadherin、Vimentin、β-actin 一抗（1∶2 000），4℃孵育過夜，TBS 洗膜，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，TBS 洗膜，滴加ECL 化學(xué)發(fā)光液，曝光、顯影，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin 條帶灰度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩樣本比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖能力比較

對(duì)照組、空載組、沉默組Brd U 陽性率分別為（26.48±2.79）%、（23.52±2.57）%、（13.29±2.06）%，3 組Brd U 陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=38.560，P=0.000）。與對(duì)照組、空載組比較，沉默組Brd U 陽性率降低（P＜0.05）；對(duì)照組與空載組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 EphA2對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響 （DAPI染色×200）

2.2 細(xì)胞遷移能力比較

對(duì)照組、空載組、沉默組細(xì)胞劃痕愈合率分別為（83.16±8.31）%、（82.35±7.24）%、（34.24±5.27）%。3 組細(xì)胞劃痕愈合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=78.869，P=0.000）。與對(duì)照組、空載組比較，沉默組細(xì)胞劃痕愈合率降低（P＜0.05）；對(duì)照組與空載組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 EphA2對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 （DAPI染色×100）

2.3 細(xì)胞侵襲能力比較

對(duì)照組、空載組、沉默組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（326.74±33.15）個(gè)、（331.27±34.59）個(gè)、（126.23±26.18）個(gè)。3 組穿膜細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=68.997，P=0.000）。與對(duì)照組、空載組比較，沉默組穿膜細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）；對(duì)照組與空載組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 EphA2對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 （0.1%結(jié)晶紫染色×100）

2.4 3 組細(xì)胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、Ecadherin、Vimentin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組、空載組、沉默組細(xì)胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組、空載組比較，沉默組EphA2、Wnt1、β-catenin、Vimentin mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05），E-cadherin mRNA 相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；對(duì)照組與空載組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組細(xì)胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （n=5，±s）

表2 3組細(xì)胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （n=5，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與空載組比較，P ＜0.05。

Vimentin mRNA 0.92±0.11 0.90±0.10 0.63±0.07①②14.574 0.000組別對(duì)照組空載組沉默組F 值P 值EphA2 mRNA 1.78±0.17 1.82±0.18 0.37±0.11①②38.560 0.000 Wnt1 mRNA 1.26±0.13 1.31±0.13 0.64±0.09①②49.869 0.000 β-catenin mRNA 0.98±0.11 0.95±0.09 0.51±0.08①②39.041 0.000 E-cadherin mRNA 1.01±0.15 0.98±0.14 1.97±0.19①②60.825 0.000

2.5 3組細(xì)胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、Ecadherin、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 組細(xì)胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組、空載組比較，沉默組EphA2、Wnt1、β-catenin、Vimentin 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05），Ecadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；對(duì)照組與空載組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3 和圖4。

圖4 3組細(xì)胞中各蛋白相對(duì)表達(dá)量

表3 3組細(xì)胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （n=5，±s）

表3 3組細(xì)胞中EphA2、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （n=5，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與空載組比較，P ＜0.05。

Vimentin蛋白0.64±0.07 0.67±0.08 0.25±0.05①②59.674組別對(duì)照組空載組沉默組F 值EphA2蛋白1.13±0.11 1.09±0.10 0.21±0.05①②164.878 Wnt1蛋白0.73±0.08 0.71±0.07 0.31±0.04①②65.271 β-catenin蛋白0.86±0.08 0.83±0.08 0.36±0.05①②77.092 E-cadherin蛋白0.57±0.06 0.55±0.07 1.14±0.11①②81.723 0.000 P 值0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

隨著外科水平的提高和放療技術(shù)的成熟，食管癌的綜合治療有了很大進(jìn)步，但由于食管癌細(xì)胞侵襲性極強(qiáng)，極易侵襲鄰近部位，治療效果仍不夠理想，術(shù)后生存率較低。EphA2 與許多腫瘤細(xì)胞的生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，其高表達(dá)是多種腫瘤細(xì)胞的共同事件，尤其在侵襲性強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常高，且EphA2 的表達(dá)也往往隨著腫瘤惡化程度增強(qiáng)而升高[6-7]。利用新興的RNA 干擾技術(shù)，通過沉默EphA2基因，阻斷EphA2基因和蛋白合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移，為臨床治療食管癌提供一種新的思路和方法。

細(xì)胞遷移是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用在腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲過程中發(fā)揮重要作用，引起細(xì)胞遷移的必要步驟是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附與解離[8]。EphA2 通過與細(xì)胞黏附分子相互作用，促進(jìn)血管生成，參與調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而維持細(xì)胞之間良好的黏附性[9]。在癌組織中，EphA2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生異常，癌細(xì)胞脫離黏附，容易游離，侵襲性增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性表型行為[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)EphA2 的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移及侵襲[11]。EphA2 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)較高，并能促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，降低EphA2 表達(dá)，可明顯抑制細(xì)胞侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為[12-13]。本研究對(duì)照組EphA2 相對(duì)表達(dá)量較高，與其在其他腫瘤中表達(dá)結(jié)果一致[14]，通過轉(zhuǎn)染EphA2 干擾序列后，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力顯著下降，提示EphA2基因沉默，對(duì)人食管癌EC9706 細(xì)胞遷移和侵襲能力具有一定的抑制作用。EphA2 高表達(dá)能減弱腫瘤細(xì)胞之間的連接，并同時(shí)增加腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，增加患者腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，影響預(yù)后[15]。由此表明，通過RNA干擾技術(shù)，沉默EphA2基因能在一定程度上抑制人食管癌EC9706 細(xì)胞的遷移和侵襲。

EMT 是上皮細(xì)胞向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，上皮源腫瘤細(xì)胞通過EMT 向周圍組織遷移。EMT發(fā)生期間細(xì)胞的黏附力減弱，侵襲性增強(qiáng)，同時(shí)伴隨上皮標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)下調(diào)以及間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin 和β-catenin 表達(dá)上調(diào)。E-cadherin 表達(dá)下調(diào)和β-catenin 核轉(zhuǎn)位是EMT 的標(biāo)志性變化，是腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲的基礎(chǔ)條件。Wnt/βcatenin 信號(hào)通路參與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT 過程，腫瘤細(xì)胞中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路被異常激活，βcatenin 在胞質(zhì)中聚集，激活下游靶基因，并可與E-cadherin 結(jié)合，形成β-catenin/E-cadherin 復(fù)合物，使細(xì)胞之間的黏附性減弱，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT，增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲的能力。在乳腺癌組織中及人胃癌細(xì)胞中，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路與癌細(xì)胞的EMT 及侵襲和遷移密切相關(guān)[16-17]。本研究對(duì)照組Wnt1、β-catenin mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量均較高，提示在Wnt/β-catenin 信號(hào)通路人食管癌EC9706 細(xì)胞被激活，通過干擾EphA2 表達(dá)后Wnt1、β-catenin mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量均下降，E-cadherin mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，Vimentin mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，表明Wnt/β-catenin 信號(hào)通路被抑制，并阻止癌細(xì)胞EMT，提示EphA2基因沉默抑制人食管癌EC9706 細(xì)胞侵襲和遷移，可能與癌細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路失活相關(guān)。

綜上所述，EphA2基因沉默對(duì)人食管癌EC9706 細(xì)胞遷移和侵襲具有一定的抑制作用，其作用機(jī)制可能與Wnt/β-catenin 信號(hào)通路失活相關(guān)，抑制細(xì)胞EMT，降低細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，為臨床治療食管癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。EphA2基因在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲也存在一定的相關(guān)性，是否為人食管癌及其細(xì)胞遷移和侵襲的特異性基因或標(biāo)志靶點(diǎn)，尚需進(jìn)一步深入研究。