宋燕州，康志龍，蘇一男，張毅明，趙新，李志偉，李偉

近年來，隨著診斷技術的不斷發(fā)展，原發(fā)性肝細胞肝癌患者的早期發(fā)現(xiàn)率得到了明顯的提高，且針對肝癌發(fā)生及發(fā)展過程中分子機制的研究為肝癌的治療提供了不同的靶位點，使得肝癌患者預后較前有了顯著提高。然而，受困于其較高的惡性程度及治療措施的限制性，導致因肝癌所致死亡人數(shù)仍高居于所有腫瘤性死亡患者的第四位［1，2］。NEK7（NIMA-related kinase 7）是一種與細胞周期調控及微管形成有著密切關系的蛋白激酶，研究表明其家族成員在肝癌、膽管癌、乳腺癌及卵巢癌等多種腫瘤細胞中均具有不同程度的異常表達［3-5］，而其本身也與膽囊癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系［6］。本研究擬探究NEK7在肝癌組織中的表達情況，并探究其與肝癌患者生存時間的關系，以期為肝癌的分子靶向治療提供新的基因位點。

1 資料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中mRNA預后分子與NEK7之間相關性研究

從TCGA資料庫（http：//gdac.broadinstitute.org/）下載371例具有完整mRNA數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的患者，采用Illumina HiSeq mRNA Seq和Illumina HiSeq miRNA Seq 3級數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)的整合，Cox回歸分析和LASSO計算重要預后變量，Spearman相關性分析進行與肝癌預后密切相關的各個mRNA分子與目的基因NEK7表達的相關性分析。

1.2 肝癌患者臨床資料統(tǒng)計與歸納、分析

本研究收集了醫(yī)院2011年1月~2013年6月行手術治療且經病理結果證實的85例原發(fā)性肝細胞肝癌患者的相關病例資料進行統(tǒng)計、歸納、分析。針對所有患者進行術后隨訪，術后失訪患者13例，有效隨訪72例。所有患者及健康體檢者均得到本人或家屬的知情同意，并報我院倫理委員會批準。

1.3 主要試劑

NEK7引物由北京三博遠志生物公司合成，NEK7單克隆抗體購自美國Proteintech公司，F(xiàn)ast200總RNA提取試劑盒購自飛捷生物公司，SP-9000通用型試劑盒購自日本TAKARA公司，DAB顯色劑購自中國中杉生物公司，Leica2126石蠟切片機購自萊卡儀器有限公司，顯微鏡及圖像掃描儀購自奧林巴斯公司，PCR儀購自Roche公司。

1.4 免疫組化探究不同組織NEK7表達情況

于生物標本庫中調取以上所述85例肝癌患者手術切除肝癌標本，隨機選取20例標本，距腫瘤邊緣1~2 cm處切取相同大小癌旁組織，對照組采用20例正常肝臟組織（以上標本均經病理結果確認），所有組織均固定于10%甲醛溶液中，24 h時后取出，固定組織后進行包埋，制作蠟塊、切片后進行免疫組織化學染色。石蠟切片60℃烘烤2 h，二甲苯溶液及乙醇進行脫蠟水化，抗原修復后于BSA封閉液中孵育，分別添加1∶200稀釋后NEK7單克隆抗體、SV試劑盒中聚合HRP標記抗羊IgG，DAB顯色、蘇木素復染后予以脫水、透明化，封片后予以烤干。NEK7表達結果的判定流程：隨機觀察5個400倍視野，計算陽性表達NEK7細胞/總細胞數(shù)，按以下數(shù)據(jù)對組織進行分類：陰性表達：0~30%；弱陽性表達：30%（含30%）~60%，強陽性表達：60%（含60%）以上。

1.5 隨訪信息

針對所有肝癌患者，自其手術后進行電話隨訪，以患者死亡時間為隨訪終止時間，85例肝癌患者中，失訪患者13例，有效隨訪72例。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間差異的比較采用卡方檢驗及t檢驗，檢驗不同NEK7表達情況與肝癌患者生物學特征之間的關系，分析影響肝癌患者的預后因素，Kaplan-Meier繪制NEK7陽性與陰性患者的生存曲線。以上比較均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 mRNA預后分子與NEK7之間相關性研究

371例具有完整mRNA數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的患者，經過Cox回歸分析和LASSO計算后CCDC21、GTF3C2和DBF4為與患者預后密切相關的mRNA分子，Spearman相關性分析表明CCDC21及GTF3C2與NEK7之間的表達具有顯著的相關性（表1），提示NEK7與肝癌的關系密切。

表1 mRNA數(shù)據(jù)與NEK7之間的相關性

2.2 免疫組化探究不同組織NEK7表達情況

免疫組化結果表明，相較于癌旁組織及肝臟組織，肝癌組織中NEK7呈陽性表達（圖1），不同分化肝癌組織中，低分化肝癌組織NEK7呈強陽性表達，高分化肝癌組織中呈弱陽性表達（圖2），肝癌組織中NEK7陽性表達率高于癌旁組織及肝臟組織，其在三種組織中陽性表達率差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）（表2）。

圖1 不同組織NEK7表達情況A：肝癌組織；B：癌旁組織；C：肝臟組織；400×

圖2 不同分化肝癌組織NEK7表達情況A：低分化肝癌組織NEK7呈強陽性表達；B：高分化肝癌組織NEK7呈弱陽性表達，400×

表2 NEK7在肝癌、癌旁及肝臟組織中的表達情況［n（%）］

2.3 NEK7表達情況與患者病理生理指標之間關系

單因素分析比較表明，在肝癌組織中NEK7陽性表達及陰性表達與臨床病理特征如性別、年齡、是否合并肝炎、Child分級、肝癌分期、分化程度及腫瘤大小等差異情況均無相關性，與是否合并癌栓及生存時間之間則顯著相關，進一步分析則表明，組織中NEK7是否呈強陽性表達與臨床病理特征如性別、年齡、是否合并肝炎、肝癌分期、腫瘤大小等均無顯著相關性，與腫瘤的分化程度、Child分級、是否合并癌栓及生存時間之間具有相關性（表3）。

表3 NEK7表達情況與肝癌臨床病理特征關系

2.4 患者生存時間與病理生理指標之間的關系

針對可能影響患者生存時間的臨床病理特征進行單因素分析，結果表明：患者生存時間與臨床病理特征如性別、年齡、是否合并肝炎、Child分級、肝癌分期及腫瘤大小等無顯著相關性，與分化程度、是否合并癌栓及NEK7表達情況之間則具有相關性（表4）。

表4 患者生存時間與臨床病理特征之間關系

2.5 NEK7表達情況與患者生存時間之間的關系

根據(jù)肝癌組織中NEK7陽性及陰性表達情況，將患者分為兩組，Kaplan-Meier繪制患者生存時間曲線，相比較于NEK7陰性表達患者，NEK7陽性表達組患者的總生存率顯著降低（圖3）。

圖3 不同NEK7表達肝癌患者Kaplan-Meier相較于NEK7陰性表達患者，NEK7陽性表達患者生存時間顯著縮短

3 討論

1975年，Morris等［7］在對曲霉菌有絲分裂突變體的研究中，將鑒定出來的細胞周期突變體命名為nim（never in mitoshs），進一步的研究在nim中發(fā)現(xiàn)了4個等位基因nimA［8］，功能學研究表明nimA可以編碼一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，進而通過調節(jié)紡錘體極而影響有絲分裂。隨后Letwin等［9］從小鼠中分離出了與nimA相關的基因，即NEK1基因，隨后相繼分離出了與NEK1相似的基因家族，即NEK基因家族［10］。

NEK家族異常表達的結果常會導致細胞周期的調控異常，使得細胞的分化、增殖出現(xiàn)異常，進而導致腫瘤細胞的產生。Hayward等［11］研究表明乳腺癌中NEK2具有異常高表達的現(xiàn)象；Kokuryo等［12］的研究則顯示膽管癌中NEK2呈高表達狀態(tài)；Cao等［13］在肝癌細胞的研究結果則表明NEK6與肝癌的發(fā)生發(fā)展之間具有一定的關聯(lián)性。

作為NEK家族中的重要一員，NEK7在多種實體腫瘤中呈不同程度的高表達狀態(tài)，既往研究表明在膽囊癌組織中NEK7同樣呈高表達狀態(tài)，且與患者生存時間之間呈現(xiàn)顯著的相關性［6］；Yan等［14］研究顯示NEK7促進胰腺癌細胞的遷移、侵襲、粘附、增殖和肝轉移能力，NEK7的高表達患者伴隨著較差的預后生存結果。本研究結果表明相較于肝癌癌旁組織及正常肝臟組織，NEK7在肝癌組織中呈高表達狀態(tài)，研究結論與Wang等［6］膽囊癌中研究結果相一致。進一步分析表明NEK7表達水平及強度與是否合并有癌栓及肝癌組織分化程度相關，提示NEK7可能促進了肝癌細胞的分化能力及侵襲轉移能力，然而針對肝癌分期及腫瘤大小等病理學特征比較之后，NEK7陽性表達情況并無顯著差別，提示本研究樣本數(shù)據(jù)可能不夠充分，另一方面則表明NEK7可能參與了肝癌整個發(fā)生、發(fā)展過程，且影響力未隨著時間的推移而減弱。生存分析表明高表達NEK7的肝癌患者，其生存時間較低表達者顯著縮短，預后因素分析則表明NEK7為影響肝癌患者生存時間的危險因素，表明NEK7作為肝癌患者預后預測的靶標分子的可行性，針對NEK7高表達患者，術后早期即可采取有效的干預措施，節(jié)省醫(yī)療資源的同時，可有效延長術后高危肝癌患者的生存時間。

總之，鑒于NEK在各種類型腫瘤細胞系中高度表達，其可能與多種腫瘤的快速復發(fā)和不良結果相關，抑制NEK可在體外和體內對多種類型的腫瘤產生抗癌作用［15］。后續(xù)體外實驗及動物實驗研究中進一步探究NEK7與肝癌細胞生物學行為之間的相關性，及其產生影響的具體分子機制，將有可能使NEK7成為肝癌診斷及治療的靶向分子。