董奇觀，楊玉超，朱瑞武，楊巖

(遼寧省健康產業(yè)集團撫礦總醫(yī)院，1.腫瘤放射治療科；2.神經內科；3.心胸外科；4.腫瘤放射治療科，遼寧 撫順 113008)

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，患者表現為上腹不適、噯氣，易被忽略，發(fā)現時已處于中晚期[1]。了解胃癌發(fā)生發(fā)展的機制及新型分子標記物，有利于胃癌診斷和確定治療靶點。microRNAs(miRNAs)是一類高度保守、長度為19～24個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA，通過與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)互補結合，可參與增殖、分化、轉移、血管形成、免疫應答等眾多生物學過程[2]。研究[3]發(fā)現，miRNAs在腫瘤形成、轉移、血管形成、免疫應答中發(fā)揮調控作用。同時，國外研究[4]表明，miR-320a在胃癌患者血清及組織中低表達。叉頭框蛋白Q1(fork head box Q1，FOXQ1)能促進腫瘤細胞的生長、遷移[5]。生物信息學分析顯示，miR-320a在FOXQl的3’端非翻譯區(qū)存在潛在結合位點[6]。本研究旨在探討miR-320a和轉錄因子叉頭框蛋白Q1(FOXQl)在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2018年1月遼寧省健康產業(yè)集團撫礦總醫(yī)院收治的40例胃癌患者為研究對象。其中男性22例，女性18例；年齡40～70歲，平均(53.71±6.43)歲；≥50歲23例，<50歲17例[7]；腫瘤直徑≥4 cm 15例，<4 cm 25例[8]；腫瘤位置：胃賁13例，胃體10例，胃竇15例，全胃3例；AJCC分期[9]：Ⅰ期8例，Ⅱ期20例，Ⅲ期12例；腫瘤分化程度[10]：低分化10例，中分化14例，高分化16例；淋巴結轉移患者18例；浸潤程度：深肌層浸潤13例，淺肌層浸潤10例，無浸潤者17例。納入標準：(1)符合《胃癌診斷標準》中診斷，并經病理學證實為腺癌[11]；(2)年齡40～70歲；(3)臨床資料完整。排除標準：(1)器質性疾病；(2)合并其他惡性腫瘤者；(3)胃癌切除前進行免疫及化療等治療；(4)臨床資料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集腫瘤組織兩份，一份放入4%甲醛中固定用于免疫化學染色，一份用于提取RNA。另在腫瘤邊緣5 cm外采集癌旁組織，液氮冷凍，-80℃保存。

1.2.2 熒光定量PCR檢測 取2 mm3樣本組織超聲勻漿，隨后加入1 mL TrizolTM Reagent試劑(上海創(chuàng)賽科技有限公司，貨號:15596026)，室溫靜置10 min后加入340 μL氯仿，震蕩均勻，4 ℃、12 000 rpm離心10 min，吸取上層水相并加入等體積的異丙醇，震蕩均，室溫反應10 min，4 ℃、12 000rpm離心10 min，棄上清液，室溫放置15 min 晾干，焦碳酸二乙酯水溶解，取l μL RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，采用核酸蛋白分析儀檢測RNA純度及濃度，然后將RNA逆轉為cDNA：計算RNA需要量(反應體系中所需RNA量為1 000 ng，體系為20 μL)，用200 μL EP 管，加入RNA的體積為V=1 000 ng/RNA 濃度，剩余體積用無RNA酶的水定容至10 μL；配制反應試劑混合液；吸取10 μL反應混合物加至每管(每管10 μL反應試劑混合物+10 μLRNA液)，混勻后置于冰上，行逆轉錄；將cDNA產物稀釋10倍，-20 ℃保存待用。反應條件：25 ℃ 10 min、30 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按Direce PCR Kit(上海鈺博科技有限公司，貨號：YB302A)說明進行PCR擴增。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。miR-320a上游引物序列：5’- GTT GGA TCC GGC GTT TCC TTC CGA CAT G-3’，下游引物序列：5’- GCT GAA TTC GTC CAC TGC GGC TGT TCC-3’，擴增片段大小為22 bp；U6上游引物序列：5’-CGC TTCA CGA ATT TGC GTG TCA T-3’，下游引物序列:5’-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3’，擴增片段大小為370 bp；FOXQ1上游引物序列：5’-CGC GGA CTT TGC ACT TTG AA-3’、下游引物序列：5’-AGC TTT AAG GCA CGT TTG ATG GAG-3’，擴增片段大小為162 bp；β-actin上游引物序列：5 ’-TCC CTG TAT GCC TCT GG-3’，下游引物序列：5’-TGT CAC GCA CGA TTT CC-3’， 擴增片段大小為134 bp。PCR擴增反應體系為20 μL[12]，加入以下試劑：cDNA1 μL、引物1 μL、TaqMan GEx MASTERMix 10 μL，加雙蒸水補至20 μL。反應條件：95 ℃反應10 min，92 ℃反應15 s，60 ℃反應l min，共40個循環(huán)。每個樣本做3個復孔。得到的數據用ABI公司(Applied Biosystems)提供的軟件SDS2.4計算[13]。選擇β-actin作為FOXQ1的內參，選擇U6作為miR-320a的內參，所有反應均在PCR儀中完成，每個樣本重復3次，得到結果的Ct值(threshold cycle)定義為達到超出實時定量PCR反應中檢測閾值時所需要的臨界循環(huán)數?！鰿t表示研究標本中miRNA相對內參的表達量，ACt =CtmiRNA-CtU6，以2-△△Ct表示miRNA相對表達量，△△Ct=(CtmiRNA癌組織-CtU6癌組織)-(CtmiRNA癌旁組織-CtU6癌旁組織)，計算出miR-320a相對表達量的平均值為0.54，以miR-320a相對表達量的平均值為界限，>0.54為miR-320a 高表達，≤0.54為miR-320a低表達。

1.2.3 免疫組織化學染色及結果判斷 免疫組織化學染色按照En Vision(試劑盒購于福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，貨號:KIT-5020)兩步法進行：使用4%甲醛固定標本24 h，常規(guī)石蠟包埋，制作切片，切片浸于3%H2O2溶液中3 min，檸檬酸高壓抗原修復10 min，-抗4 ℃孵育過夜，通用型二抗-HRP聚合物，37 ℃孵育30 min，滴加DAB顯示，顯微鏡下觀察顯色情況，蘇木素復染，0.1%鹽酸乙醇分化，PBS沖洗返藍，乙醇脫水、透明、中性樹膠封固。用陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。FOXQl結果由兩位有經驗的病理醫(yī)師采用Greens-pan半定量法判斷陽性細胞及細胞染色強度[14-15]；每例觀察5個以上高倍視野(400×)，計數不少于1 000個細胞中的陽性細胞數。FOXQ1表達陽性參考Liang等[16]的判定標準：陽性細胞率≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強度淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將陽性細胞率得分和染色強度得分相乘即為最后得分，0～3分定義為陰性，4～12分定義為陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 癌組織和癌旁組織miR-320a表達量比較

癌組織中miR-320a相對表達量低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織和癌旁組織miR-320a及FOXQl mRNA相對表達量比較

2.2 癌組織和癌旁組織FOXQl表達情況比較

FOXQl在癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2及圖1。

表2 癌組織和癌旁組織間FOXQl表達[n(%)]

2.3 miR-320a及FOXQl表達水平與胃癌患者臨床病理特征的關系

miR-320a及FOXQl表達水平與腫瘤直徑、AJCC分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移及浸潤程度有關(P<0.05)；與年齡、性別、腫瘤位置無關(P>0.05)。見表3。

表3 miR-320a及FOXQl表達水平與胃癌患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4 影響胃癌患者預后的因素

對患者進行3年隨訪，隨訪時間至2021年2月，均無失訪，以死亡為隨訪終點事件。40例患者死亡12例，3年生存率為70.00%。單因素結果顯示，腫瘤直徑、AJCC分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移、浸潤程度及miR-320a、FOXQl表達為影響患者預后的因素(P<0.05)；多因素分析顯示，腫瘤直徑、AJCC分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移及浸潤程度及miR-320a、FOXQl表達為影響患者預后的獨立因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響胃癌患者預后的因素

2.5 miR-320a及FOXQl表達與預后的關系

miR-320a低表達和FOXQl陽性表達患者3年生存率低于miR-320a高表達和FOXQl陰性表達患者(60.71%vs.91.67%,χ2=3.832,P=0.039,56.00%vs.93.33%,χ2=6.222,P=0.013)。見圖2及圖3。

3 討論

2012年全球新發(fā)胃癌95.1萬，我國約占50%，且死亡率約占45%[17]。因此，早診斷及治療對改善預后至關重要。miRNA是一類高度保守、長約19～24個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA，可能參與了增殖、分化、轉移、血管形成、免疫應答等眾多生物學過程[18]。miR-320a已被證明是一種具有抑制腫瘤增殖和侵襲功能的miRNA[19-20]。在結腸癌中，miR-320a可抑制細胞轉移、生長及增殖[21]；miR-320a通過抑制Wnt/p-catenin通路抑制前列腺癌的干細胞特性[22]；在白血病細胞中miR-320a通過靶定CD71抑制增殖[23]；在非小細胞肺癌中，miR-320a可抑制內皮細胞血管形成和腫瘤細胞遷移[24]。此外，miR-320a 能重塑基質纖維細胞，減慢腫瘤發(fā)展。另有報道[25]表明，miR-320a具有癌基因的作用。丁兢等[26]研究表明，miR-320a/c/d通過抑制抑癌基因的表達促進肝癌細胞遷移。而本研究證實，癌組織中miR-320a相對表達量低于癌旁組織(P<0.05)，與唐淑麗等[27]研究一致，說明胃癌腫瘤形成過程中，miR-320具有抑癌基因功能，其表達降低促進胃癌的形成。miR-320a表達與腫瘤直徑、AJCC分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移及浸潤程度有關(P<0.05)，因此推測miR-320a表達降低參與了胃癌發(fā)生發(fā)展，與胃癌細胞增殖、侵襲與遷移中有關。此外， miR-320a低表達的患者3年生存率低于miR-320a高表達的患者(P<0.05)，提示隨著miR-320a表達的降低，胃癌病情進展快，惡性程度越高，可進一步促進癌細胞的轉移，因此預后較差，進一步說明miR-320a可能是潛在的胃癌治療靶點。

FOXQ1是核轉錄調控因子，在發(fā)育、代謝、腫瘤及老化中具有重要作用，其通過TGF-B/Smad途徑作為NF-kB的核內拮抗劑，阻止NF-kB乙酰化，減少NF-kB過度激活引起的腫瘤；并可減少Shh通路信號轉導，抑制腫瘤侵襲轉移。同時，Wnt/3-catenin通路參與調控細胞的發(fā)育、增殖、分化和粘附[28]。相關研究[29]表明，FOXQ1與胃上皮分化有關。同時楊欣怡等[30]研究發(fā)現，FOXQ1表達與腫瘤轉移及預后明顯相關。本研究發(fā)現，FOXQl mRNA相對表達量高于癌旁組織(P<0.05)，且FOXQl在癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織(P<0.05)，提示FOXQl與胃癌發(fā)生相關。FOXQl表達與腫瘤直徑、分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移及浸潤程度有關，提示FOXQl高表達可促進胃癌細胞增殖、侵襲與遷移。此外，FOXQl陽性患者3年生存率低于FOXQl陰性患者(P<0.05)，提示胃癌中FOXQl陽性表達患者預后較差，可能與其對胃癌細胞轉移和侵襲能力調節(jié)有關，說明miR-320a可能是潛在的胃癌治療靶點。但本研究納入例數較少，且對預后隨訪時間較短，下一步研究將擴大樣本量進一步論證。

綜上，miR-320a低表達和FOXQl陽性與胃癌生長、侵襲、轉移及不良預后相關，可作為病情評估和預后的靶標分子。