張春，丁甜甜，李慧，劉遠婷，鄭茜

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院中醫(yī)科，新疆 烏魯木齊 830000)

肺癌發(fā)病率居全球惡性腫瘤前列，發(fā)病率高達45.39%[1]，由于肺癌診斷時多處于中晚期，治療效果不甚理想，5年生存率<20%[2]。手術(shù)、放化療及靶向藥物治療是主要治療方式，但手術(shù)治療對適應(yīng)證的要求較高，僅限于Ⅰ～Ⅲa期肺癌[3]；放化療及靶向藥物治療伴隨的不良反應(yīng)明顯，部分患者不耐受[4]。中醫(yī)藥防治腫瘤已有數(shù)千年歷史，積累了寶貴經(jīng)驗，根據(jù)中醫(yī)辨證施治可恢復(fù)和增強機體自然免疫力，扶正固本，起到輔助抗腫瘤作用。腫瘤的生長與擴散具有血管依賴性[5]，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[6-7]，抗腫瘤血管生成藥物成為肺癌不可或缺的治療手段之一，其可使現(xiàn)有腫瘤血管退化，并抑制腫瘤新生血管生成，從而阻斷腫瘤生長必須的營養(yǎng)供給[8]。本研究擬采用Lewis肺癌荷瘤小鼠模型觀察消積抑癌外敷方對腫瘤血管生成及VEGF表達的影響，探討消積抑癌外敷方的抗腫瘤效果和作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雌性C57BL/6小鼠20只，體質(zhì)量(20±2)g，4～6周齡，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心[許可證號：SCXK(新) 2018-0002)]。Lewis肺癌細胞株選自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。

1.2 主要實驗儀器和試劑

SSB-2超凈臺(上海凈化設(shè)備廠)、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國力高公司)、倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、低溫高速離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠)、HR-200型電子天平(日本LIMITED公司)、細胞培養(yǎng)瓶(德國Greiner公司)、Prism7000型熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀(美國ABI公司)、組織包埋機和石蠟切片機(德國Leica公司)。VEGF單克隆抗體試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)；熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR)配套試劑盒和總核糖核酸(RNA)抽提試劑購自美國Thermo Scientific公司；VEGF信使核糖核酸(mRNA)引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

消積抑癌外敷方：當歸30 g、川芎30 g、乳香30 g、沒藥30 g、紅花30 g、赤芍30 g、五靈脂60 g、莪術(shù)120 g、苦參120 g、山慈菇120 g、透骨草60 g、全蝎40 g、蜈蚣40條、豬蹄甲30 g、土鱉蟲40 g、商陸120 g、元胡120 g、青黛60 g、拳參40 g、仙鶴草60 g、丹皮60 g、白鮮皮60 g、丹參30 g、浙貝母120 g、烏梅120 g、蜂房120 g、蛇莓60 g、冰片9 g，將冰片溶解于46°白酒500 mL中制備成冰片酒。上述中藥材研成粉末，用46°冰片酒調(diào)和成膏狀，消毒滅菌裝瓶，制成外敷膏劑。外敷膏劑由新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院中藥房制備，鑒定及方劑質(zhì)量控制由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院負責(zé)，采用薄層色譜法鑒別外敷膏劑的活性成分，其中當歸、川芎、乳香、沒藥、紅花等中藥成分的分離度較好、專屬性較強，陰性對照無明顯干擾。外敷膏劑成型性好，具有適宜的機械強度和黏附性，制備工藝穩(wěn)定合理，質(zhì)量控制方法準確、可靠、專屬性強，質(zhì)量評價較優(yōu)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備及分組 實驗前C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。采用動物移植腫瘤實驗法制備Lewis肺癌荷瘤小鼠模型[9]。將Lewis肺癌細胞株的凍存管從液氮中取出，迅速放入37 ℃的水浴鍋中至內(nèi)容物完全融化，約3 min快速復(fù)蘇，置于完全培養(yǎng)基中，移入37 ℃恒溫、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。當細胞處于指數(shù)生長期時，取生長良好的細胞經(jīng)胰酶消化后，用計數(shù)板計數(shù)，將濃度調(diào)整至1×107個/mL以供注射。將2×106個Lewis肺癌細胞接種于每只小鼠皮下，制備Lewis肺癌小鼠模型，每天檢查腫瘤生長情況，接種8 d后開始實驗。20只C57BL/6小鼠隨機分為荷瘤對照組和治療組，每組各10只。

1.3.2 治療方法 對照組小鼠瘤體表面外敷面糊(面粉+生理鹽水調(diào)成糊狀物)，面糊加熱至30 ℃使用，30 min/次，3次/d，連續(xù)30 d。治療組小鼠瘤體表面外敷消積抑癌膏，按照0.79 mL/20 g體重標準給藥，膏藥加熱至30 ℃使用，30 min/次，3次/d，連續(xù)30 d。

1.4 檢測指標

(1)療程結(jié)束后處死小鼠，剝離腫瘤組織稱重瘤質(zhì)量；將腫瘤組織分為兩部分，一部分用多聚甲醛固定，另一部分冷凍于液氮中備用；(2)免疫組化法檢測CD34和VEGF蛋白表達量，多聚甲醛固定組織，經(jīng)過脫水、固定、包埋等步驟制作石蠟切片，石蠟切片浸泡于500 mL的抗原修復(fù)工作液，加熱煮沸20 min后冷卻至室溫，取出組織切片用磷酸鹽緩沖液沖洗3 min、自來水沖洗3 min。組織切片晾干后滴加10%非免疫羊血清，孵育30 min。鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP)進行免疫組化染色：加入CD34和VEGF單克隆抗體試劑盒中的一抗工作液40 μL，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的CD34和VEGF二抗工作液，37 ℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min。滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色液50 μL，染色時間大約5～10 min，顯微鏡下觀察。CD34染色標記微血管進行微血管密度計數(shù)，計算腫瘤組織中CD34染色的微小血管。(3)Western blot檢測VEGF蛋白表達，100 mg液氮冷凍的腫瘤組織，加入蛋白裂解液1 mL，1 000～3 000 rpm高速勻漿3次，離心取上清液，調(diào)整所有蛋白樣本至等濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維束薄膜上，封閉，加入VEGF一抗，4 ℃孵育過夜。取膜，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次5 min。再加入辣根過氧化物酶標記的VEGF二抗，封口，37 ℃孵育1 h。磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次10 min。采用辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光法(HRP-ECL)曝光，將膜置于曝光板上，取出膠片浸入顯影液至完全曝光，清水沖凈晾干。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照計算VEGF蛋白的相對表達量。(4)RT-qPCR法檢測VEGF mRNA相對表達量， 100 mg液氮冷凍的腫瘤組織用0.25%胰蛋白酶消化細胞，10 000 rpm離心棄上清，加入Trizol試劑抽提細胞總RNA，干燥RNA沉淀物，保存于-20 ℃待檢。VEGF上游引物：5′-TCA GGT CTG CTC AT TCT TA-3′，下游引物：5′-CAG CCA TTC AGT CTA CGT-3′，擴增片段474 bp，β-actin為內(nèi)參基因，上游引物：5′-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3′，下游引物：5′- GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3′，擴增片段268 bp。將相關(guān)試劑(逆轉(zhuǎn)錄酶10 U、核糖核酸抑制酶2 μmol/L、dNTP 2.5 μmol/L、Taq DNA聚合酶5 μmol/L，引物5 μmol/L等，反應(yīng)體積100 μL)置于冰盒上，混勻。將離心管置于預(yù)熱的Prism7000型熒光定量PCR儀， RT-qPCR反應(yīng)條件：96 ℃ 4 min， 94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。按照RT-qPCR說明書，采用2-ΔΔCt法計算VEGF mRNA相對表達量。

1.5 VEGF蛋白評分標準

由病理中心兩名醫(yī)師獨立閱片，采用Bresalier半定量法分兩部分評分[10]：(1)染色深淺度評分：0分為不顯色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；(2)陽性細胞數(shù)評分：0分為陽性細胞數(shù)<5%，1分為陽性細胞數(shù)5～25%，2分為陽性細胞數(shù)26%～50%，3分為陽性細胞數(shù)51%～75%，4分為陽性細胞數(shù)≥76%。累計得分0～1分為(﹣)，2～3分為(+)，4～5分為(++)，6～7分為(+++)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠瘤質(zhì)量比較

治療組的瘤質(zhì)量(1.37±0.28)g低于荷瘤對照組(0.61±0.15)g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.566，P<0.001)。見圖1。

2.2 兩組微血管密度計數(shù)比較

治療組的微血管密度計數(shù)(43.59±8.33)小于荷瘤對照組(30.34±6.45)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.977，P=0.001)。見圖2。

2.3 兩組VEGF蛋白表達水平比較

對照組和治療組的VEGF表達均為陽性，且治療組VEGF表達的陽性等級低于對照組。治療組的VEGF蛋白表達量(1.07±0.26)低于荷瘤對照組(0.76±0.19)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.044，P=0.007)。見表1、圖3及圖4。

表1 免疫組化VEGF蛋白表達水平比較 [n(%)]

2.4 兩組VEGF mRNA表達量比較

治療組的VEGF mRNA相對表達量(1.93±0.47)低于對照組(1.35±0.34)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.162，P<0.005)。見圖5。

3 討論

本研究探討消積抑癌外敷方對Lewis肺癌荷瘤小鼠的腫瘤血管生成以及VEGF表達的影響，結(jié)果顯示，治療組的微血管密度計數(shù)小于荷瘤對照組，說明消積抑癌外敷方可以抑制腫瘤血管生成。荷瘤對照組、治療組的VEGF表達均為陽性，但治療組VEGF表達的陽性等級低于荷瘤對照組，并且治療組的VEGF蛋白表達量以及VEGF mRNA低于荷瘤對照組，上述可以證明消積抑癌外敷方可下調(diào)Lewis肺癌荷瘤小鼠VEGF表達，具有抗腫瘤潛力。

中醫(yī)藥理認為肺癌的發(fā)病以臟腑虧虛、氣血失調(diào)、正氣不足為內(nèi)因，內(nèi)邪伏留易致外邪侵襲，在各種致癌因素的作用下，外感病日久不愈，邪氣伏著不解，成為內(nèi)伏之邪，內(nèi)外合邪發(fā)病，引起人體氣滯血瘀，痰凝毒結(jié)，形成腫瘤[11]。瘀血、痰濁是肺癌的主要病機，因此肺癌的治療應(yīng)從整體觀念出發(fā)，采用活血化瘀的治療方法[12]。本研究所采用的消積抑癌方多選用蟲類藥甚至有毒的藥物以通絡(luò)消積、以毒攻毒，如全蝎、蜈蚣、豬蹄甲、土鱉蟲；選用活血破瘀消積類藥物以清瘀毒，如當歸、川芎、乳香、沒藥、紅花、赤芍、五靈脂、莪術(shù)、丹參、透骨草；選用清熱解毒散結(jié)類藥物如苦參、山慈菇、商陸、元胡、青黛、拳參、仙鶴草、丹皮、白鮮皮；浙貝母、烏梅，蜂房、蛇莓；輔以冰片、白酒的辛散透皮，引藥到達病所。上述藥物組方嚴謹，君臣佐使，諸藥配伍共奏清熱解毒、活血消積、以毒攻毒之功效。從西醫(yī)病理機制的角度分析，腫瘤血管生成為腫瘤迅速生長、侵襲和轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)和能量。VEGF是腫瘤血管生成刺激因子，可促進血管內(nèi)皮細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成，提高血管通透性，加速腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移擴散[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療組的微血管密度計數(shù)、瘤質(zhì)量、VEGF蛋白和VEGF mRNA表達量均少于對照組，說明消積抑癌外敷方可抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長，具有抗腫瘤潛力。孫國鈞等[15]指出由黃芪、白術(shù)、石見穿、蜂房等中藥組成的益氣消征方，可行氣活血、散瘀止痛、攻毒效果，降低Lewis荷瘤小鼠VEGF蛋白和VEGF mRNA的表達，減慢腫瘤的生長速度，降低腫瘤血管形成率；Zhang等[16]也表示大黃酚活性成分通過調(diào)節(jié)ROS/HIF-1a/VEGF信號通路，抑制CD31、CD34和血管生成素的表達，進而阻礙肺癌腫瘤血管生成，上述兩項報道均與本研究結(jié)論一致。這可能是因為：消積抑癌外敷方的中藥成分如當歸、苦參、川穹等能夠有效抑制VEGF，從而阻斷腫瘤血管生成，抑制腫瘤生長，作用機制可能與阻斷JAK2/STAT3信號通路、減輕機體免疫抑制、下調(diào)瘤組織基質(zhì)金屬蛋白酶13和成纖維細胞生長因子2的表達有關(guān)[17]。

綜上所述，消積抑癌外敷方可下調(diào)Lewis肺癌荷瘤小鼠VEGF表達，抑制腫瘤血管生成，減輕瘤質(zhì)量，為臨床治療提供新的思路法。