鄭云芳，李晨，張芳，汪少蕓

(福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108)

0 引言

海鱸魚學名為日本真鱸，肉質(zhì)鮮美[1]、口感爽滑、滋味醇香、營養(yǎng)豐富，富含多種維生素、不飽和脂肪酸以及各種人體所需的氨基酸[2]，有健脾胃、補肝腎、止咳化痰等作用.熱處理是鱸魚等食品加工過程中常見的一種方式.加熱處理可降低食品中的致病菌的數(shù)量，有效延長食品的貨架期，但是會改變食品的顏色、風味.蛋白質(zhì)分子的規(guī)整結構受熱誘導會展開或者折疊，使原本緊密的結構變得松散.而溫度過高時，蛋白質(zhì)分子間的運動加快，維持蛋白質(zhì)一級和二級結構的氫鍵、肽鍵等共價鍵被破壞，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集[3].蛋白分子肽鏈受熱后，連接肽鏈的共價鍵被破壞，可能引起蛋白質(zhì)之間的相互作用發(fā)生改變，導致蛋白質(zhì)的結構發(fā)生改變[4]，最終改變肌原纖維蛋白的理化特性.不同的加熱溫度、加熱時間和加熱方式對鱸魚蛋白的結構產(chǎn)生影響，進而影響蛋白的功能特性.

本研究通過設置不同的加熱溫度和時間，測定巰基質(zhì)量摩爾濃度、濁度、紫外吸收光譜、內(nèi)源性熒光、拉曼光譜、Ca2+-ATPase等指標來反映蛋白結構和功能特性的變化，并利用主成分和聚類分析等初步建立構象變化與功能特性之間的聯(lián)系.通過研究相關的理化指標，將蛋白結構的變化與功能特性進行有效關聯(lián)，可以為蛋白類食品的功能化設計打下一定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鮮活珠海鱸魚，購于福州市永輝超市；EGTA，購自美國Sigma公司；五水合硫酸銅、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉，購自西隴科學股份有限公司；5, 5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，購自麥克林生化科技公司；超微量ATP酶(Ca2+)測試盒，購自南京建成研究所；酒石酸鉀鈉，購自廣東光華化學廠.所有藥品均為分析純.

1.2 主要儀器設備

高速冷凍離心機 (TG16-WS湘智離心機有限公司)；紫外可見分光光度計 (GENESYS 10S 美國賽默飛世爾科技公司)；熒光光譜儀 (Fluoromax-4 法國Horiba Instrument公司)；Zetasizer激光粒度分析儀 (ZEN3600 英國馬爾文公司)；多功能酶標儀 (SpectraMax i3x 美谷分子儀器上海有限公司).

1.3 實驗方法

1) 肌原纖維蛋白的提取.肌原纖維蛋白的提取是參照Park[5]的方法，略作修改.

2) 熱處理.將制得的肌原纖維蛋白溶液放置于離心管中，利用水浴鍋對肌原纖維蛋白進行加熱處理，當加熱溫度和時間達到設計的條件時取出樣品，置于冰水浴中冷卻至室溫.

3) 測定巰基質(zhì)量摩爾濃度.利用Ellman法測定肌原纖維蛋白的總巰基和活性巰基的質(zhì)量摩爾濃度[6].

4) 測定表面疏水性.利用溴酚藍法測定肌原纖維蛋白的表面疏水性[7].將1 mL肌原纖維蛋白與200 μL 1 mg·mL-1的溴酚藍混合，振蕩反應10 min，5 000 r·min-1離心15 min，取上清液稀釋10倍后在595 nm處測定吸光度.以溴酚藍結合量表示表面疏水性.每個樣品重復測定3次.

5) 紫外吸收光譜測定.根據(jù)Wang等[8]的方法，略作修改.將加熱后的肌原纖維蛋白溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋至0.5 mg·mL-1，掃描范圍為190～400 nm.每個樣品重復測定5次.

6) 內(nèi)源性熒光測定.參照Xu等[9]的方法測定.將肌原纖維蛋白濃度調(diào)整為0.5 mg·mL-1，設置激發(fā)波長為295 nm，發(fā)射光譜范圍為300～450 nm.每個樣品掃描5次.

7) Ca2+-ATPase活性檢測.利用超微量ATP酶(Ca2+)測試盒測定鱸魚肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活性的變化.

8) 拉曼光譜測定.采用InVia Reflex激光顯微拉曼光譜儀測定熱處理后肌原纖維蛋白的二級結構，設置激光波長為785 nm，掃描范圍400～3 600 cm-1，光譜分辨率為1 cm-1.每個樣品重復測定3次.

9) 濁度測定.參照韓敏義等[10]的方法測定熱處理前后的濁度.將蛋白濃度調(diào)整為1 mg·mL-1，測定處理前后的樣品在340 nm處的吸光度，以磷酸鹽緩沖液作為空白.每個樣品重復測定3次.

10) 乳化性測定.根據(jù)Agyare等[11]的方法測定乳化性.取3 mL蛋白溶液，加入1 mL花生油，10 000 r·min-1高速剪切均質(zhì)1 min，吸取50 μL乳化液，加入5 mL 0.1 g·mL-1SDS溶液，測定乳化液在500 nm處的吸光值，記作A0.靜置10 min后，重復上述操作，將測得的吸光值記作A10.

11) 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析.采用SPSS軟件進行相關性和顯著性分析，采用Origin軟件進行作圖.利用Simca多元變量統(tǒng)計分析軟件進行主成分和聚類分析.

2 結果與討論

2.1 巰基質(zhì)量摩爾濃度

加熱溫度和加熱時間對巰基質(zhì)量摩爾濃度的影響如圖1所示.由圖1可知，不同加熱溫度處理后的肌原纖維蛋白的活性巰基質(zhì)量摩爾濃度先增后減.熱處理前后蛋白的總巰基質(zhì)量摩爾濃度減少.剛開始巰基質(zhì)量摩爾濃度的下降速度快，而后下降速度減緩.當加熱溫度為90 ℃時，肌原纖維蛋白總巰基質(zhì)量摩爾濃度下降了13.90%.90 ℃時肌原纖維蛋白的活性巰基質(zhì)量摩爾濃度為83.03 mmol·kg-1，下降了17.16%.

注： 不同小寫字母表示熱處理與對照組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 以下同 圖1 加熱溫度和加熱時間對巰基質(zhì)量摩爾濃度的影響Fig.1 Effect of heating temperature and heating time on sulfhydryl molality

隨著加熱時間的延長，肌原纖維蛋白的總巰基和活性巰基的質(zhì)量摩爾濃度逐漸下降.當加熱時間為20 min時，肌原纖維蛋白的總巰基質(zhì)量摩爾濃度為84.47 mmol·kg-1，下降了6.15%，活性巰基質(zhì)量摩爾濃度為65.07 mmol·kg-1，下降了4.20%.

總巰基所具備的活性為各種反應提供了物質(zhì)基礎[12].蛋白質(zhì)的構象變化常常與巰基和疏水基團的暴露有關[13].熱處理后巰基質(zhì)量摩爾濃度下降的原因是因為加熱使肌原纖維蛋白結構發(fā)生轉(zhuǎn)變，埋藏于蛋白分子內(nèi)部的巰基轉(zhuǎn)移至表面，活性巰基增加.溫度進一步上升，高溫促進了巰基的氧化反應，蛋白完全變性和聚集，生成二硫鍵和聚集體，巰基被掩蓋，因而質(zhì)量摩爾濃度降低.

2.2 表面疏水性

表面疏水性的大小以溴酚藍結合質(zhì)量表示，加熱溫度和加熱時間對表面疏水性(m溴酚藍)影響如圖2所示.由圖2可以看出，隨著加熱溫度的提高，肌原纖維蛋白的表面疏水性先增大后減小.當加熱溫度為60 ℃時，肌原纖維蛋白的表面疏水性達到最大.繼續(xù)增大加熱溫度，表面疏水性減小.隨著加熱時間的延長，肌原纖維蛋白的表面疏水性呈現(xiàn)減小的趨勢.當加熱時間為20 min時，肌原纖維蛋白的表面疏水性降至最低點，比對照組下降了19.18%.

圖2 加熱溫度和加熱時間對表面疏水性的影響Fig.2 Effect of heating temperature and heating time on surface hydrophobicity

疏水域的暴露被認為是形成大型肌球蛋白聚集體的先決條件.Benjakul等[14]發(fā)現(xiàn)在加熱過程中，魚類肌原纖維蛋白的表面疏水性的變化可以分為2個階段.第一階段，表面疏水性隨溫度升高逐漸增大；第二階段，疏水性殘基完全暴露于極性環(huán)境中，表面疏水性基本不變.

2.3 紫外吸收光譜

濁度大小以蛋白質(zhì)芳香族氨基酸的吸光值表示.加熱溫度和加熱時間對紫外吸收光譜的影響如圖3所示.圖3表明肌原纖維蛋白的紫外吸收隨著加熱溫度的增大而增強，最大吸收峰發(fā)生藍移.超過40 ℃時，紫外吸收增加的程度較為明顯.當加熱溫度達到90 ℃時，與不加熱的肌原纖維蛋白相比，加熱處理后的肌原纖維蛋白的最大吸收峰值增加了33.84%.隨著加熱時間的延長，肌原纖維蛋白的紫外吸收光譜的紫外吸光度逐漸增加.當加熱時間為20 min時，肌原纖維蛋白的最大吸收峰值增加了7.26%.

圖3 加熱溫度和加熱時間對紫外吸收光譜的影響Fig.3 Effect of heating temperature and heating time on ultraviolet absorption spectra

熱處理使肌原纖維蛋白紫外吸收強度增加的原因可能是熱處理使蛋白質(zhì)的結構展開，構象發(fā)生改變，埋藏在分子內(nèi)部的生色基團暴露，導致紫外吸收特征峰值升高[15].紫外吸收光譜圖中的最大吸收峰發(fā)生藍移，說明蛋白質(zhì)所處的環(huán)境極性增加，蛋白質(zhì)結構展開[16].

2.4 熒光光譜

加熱溫度和加熱時間對熒光光譜的影響如圖4所示.由圖4可知，隨著加熱溫度的升高，肌原纖維蛋白的內(nèi)源性熒光強度逐漸降低，發(fā)生了熒光猝滅，最大吸收峰輕微紅移.當加熱溫度為90 ℃時，熒光強度下降了9%.隨著加熱時間的延長，肌原纖維蛋白的內(nèi)源性熒光強度下降.當加熱時間為20 min時，肌原纖維蛋白的內(nèi)源性熒光強度下降的程度不明顯，僅減少了1.92%.加熱可能造成蛋白結構的破壞，引起生色基團暴露在溶劑中，導致熒光強度降低[17].熱處理改變了蛋白肽鏈的折疊形式，蛋白展開，色氨酸殘基暴露于表面.活性基團的暴露增強了分子間相互作用，造成分子的再聚集，進一步導致更多色氨酸殘基被包埋于疏水區(qū)域，從而引起內(nèi)源熒光強度的下降.

圖4 加熱溫度和加熱時間對熒光光譜的影響Fig.4 Effect of heating temperature and heating time on fluorescence spectra

吸收峰位波長紅移原因可能是由于加熱使肌原纖維蛋白內(nèi)部疏水結構與區(qū)域暴露，色氨酸側鏈基團暴露在蛋白質(zhì)分子外部，處于極性環(huán)境中.袁麗等[18]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過不同的溫度處理后鳙魚肌球蛋白的熒光強度隨溫度升高，逐漸降低，出現(xiàn)熒光猝滅的現(xiàn)象.

2.5 Ca2+-ATPase活性

蛋白質(zhì)酶促反應中無機磷的質(zhì)量分數(shù)變化表示熱處理過程中Ca2+-ATPase的變化情況, 如圖5所示.隨著加熱溫度的升高，Ca2+-ATPase活性逐漸減小.當加熱溫度達到50 ℃時，肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase的活性急劇降低.當加熱溫度超過80 ℃時，Ca2+-ATPase的活性幾乎降為0，此時隨著加熱溫度的繼續(xù)升高，Ca2+-ATPase的活性不變.

圖5 加熱溫度和加熱時間對Ca2+-ATPase的影響Fig.5 The effect of heating temperature and heating time on Ca2+-ATPase

Ca2+-ATPase活性隨加熱時間延長而降低.Ca2+-ATPase活性在加熱初始階段，急劇下降，幾乎降為0.繼續(xù)延長加熱時間，肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase的活性不變.肌球蛋白與Ca2+-ATPase的活性密切相關，Ca2+-ATPase的活性下降反映了肌球蛋白的熱變性和聚集.

2.6 二級結構

拉曼光譜法不但具備無損檢測的特點，并且操作簡單，可被用于預測蛋白的二級結構.通過分析肌原纖維蛋白拉曼光譜譜圖的特征峰的峰位、峰強度以及峰面積，結合相關分析軟件可推測肌原纖維蛋白結構的變化.加熱溫度和加熱時間對二級結構的影響如圖6所示.由圖6分析可知，隨著加熱溫度的提高，α-螺旋遞減,β-折疊和無規(guī)卷曲的比例增加.與對照組相比，當加熱溫度為90 ℃時，肌原纖維蛋白的α-螺旋占比降至23.35%，下降了64.63%，此時無規(guī)卷曲和β-折疊的比例達到最大值，分別為25.50%和35.95%，增加了1.99倍和1.41倍.

圖6 加熱溫度和加熱時間對二級結構的影響Fig.6 Effect of heating temperature and heating time on secondary structure

隨著加熱時間的延長，肌原纖維蛋白的α-螺旋占比降低，β-折疊和無規(guī)卷曲的比例增加，β-轉(zhuǎn)角的比例先增后減.當加熱時間為20 min時，α-螺旋占比降至21.45%，比對照組下降了63.02%，β-折疊和無規(guī)卷曲增加至36.57%和25.18%，分別增加了97.89%和2.84倍.二級結構比例的變化說明熱處理使肌原纖維蛋白的α-螺旋向β-折疊和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化.變性是由于肌原纖維蛋白中α-螺旋區(qū)域解折疊而引發(fā)的，然后暴露疏水和巰基殘基，這些殘基隨后參與聚集和膠凝過程.

2.7 濁度

利用比色法比較濁度，可用于檢測蛋白質(zhì)聚集的程度[19].加熱溫度和加熱時間對濁度的影響如圖7所示.圖7說明經(jīng)過不同加熱溫度處理后的肌原纖維蛋白濁度逐漸增大.90 ℃時，肌原纖維蛋白的濁度顯著增加，增大了40.51%.說明此時肌原纖維蛋白發(fā)生聚集，懸浮顆粒直徑變大，濁度升高.

隨著加熱時間的延長，肌原纖維蛋白的濁度逐漸增大.當加熱時間為20 min時，肌原纖維蛋白的濁度增加了9.65%.在加熱過程中，肌球蛋白重鏈和輕鏈可能改變其構象，然后聚集形成不溶性物質(zhì).質(zhì)地和功能特性的變化與蛋白質(zhì)變性和聚集有關[20].

圖7 加熱溫度和加熱時間對濁度的影響Fig.7 Effect of heating temperature and heating time on turbidity

2.8 乳化性

加熱溫度和加熱時間對乳化性的影響如圖8所示.圖中EAI為乳化活性指數(shù)，ESI為乳化穩(wěn)定指數(shù).由圖8可知，隨著加熱溫度的升高，肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性先增后減.80 ℃時，乳化活性達到最大值為24.695 m2·g-1，乳化性增加了19.46%.60 ℃時，肌原纖維蛋白的乳化穩(wěn)定性最大，增加了42.35%.經(jīng)過加熱蛋白的結構展開，更容易向油-水界面和氣-液界擴散，乳化性的增大.過高的溫度會破壞蛋白質(zhì)在兩相界面的吸附作用，不利于形成穩(wěn)定的乳化體系.

圖8 加熱溫度和加熱時間對乳化性的影響Fig.8 Effect of heating temperature and heating time on emulsifying properties

隨著加熱時間的延長，肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性先增后減.當加熱時間為5 min時，肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性達到最大，分別為36.137 m2·g-1和33.88%.與對照組相比，肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性分別增加了1.02倍和4.92%.

2.9 主成分分析

利用多元變量統(tǒng)計分析軟件對不同加熱溫度處理后的肌原纖維蛋白理化指標進行主成分分析，結果如圖9所示.

圖9 不同加熱溫度的主成分得分圖和載荷圖Fig.9 Principal component score diagram and load diagram with different heating temperature

分解得到2個主成分.第一主成分的解釋率為0.572，第二主成分的解釋率為0.285.評分圖顯示不同加熱溫度下的樣品明顯分開，表示不同加熱溫度對肌原纖維蛋白的理化性質(zhì)有較大的影響.80 ℃和90 ℃的樣品位置接近，差別較小.α-螺旋和活性巰基的距離近，關聯(lián)性強.β-折疊、乳化性和濁度的距離近，關聯(lián)性強.α-螺旋、β-折疊、無規(guī)卷曲和乳化性被主成分介紹的程度高.

對不同加熱時間處理后的肌原纖維蛋白理化指標進行主成分分析，分解得到2個主成分.第一主成分的解釋率為0.705，第二主成分的解釋率為0.199.如圖10所示，評分圖顯示不同加熱時間下的樣品明顯分開，表示不同加熱時間對肌原纖維蛋白的理化性質(zhì)有較大的影響.不加熱的樣品與加熱處理的樣品差別較大.加熱時間為15和20 min樣品的位置接近，差別較小.濁度和無規(guī)卷曲的距離近，關聯(lián)性強.α-螺旋、Ca2+-ATPase和表面疏水性的距離近，關聯(lián)性強.

圖10 不同加熱時間的主成分得分圖和載荷圖Fig.10 Principal component score diagram and load diagram with different heatingtime

2.10 聚類分析

觀察聚類圖(圖11)發(fā)現(xiàn)，20、30、40和80 ℃被聚為1類，50和60 ℃聚為1類.70和90 ℃各自分別為1類.乳化性、總巰基、濁度、I760/I1003、I850/I830、β-折疊、α-螺旋、無規(guī)卷曲、溶解度、起泡性、Ca2+-ATPase等指標聚為1類，表明這些指標間有密切聯(lián)系.

5和10 min被聚為1類，15和20 min聚為1類、0 min為1類.總巰基、濁度、I760/I1003、I850/I830、β-折疊、α-螺旋、無規(guī)卷曲、溶解度、起泡性、Ca2+-ATPase等指標聚為1類，表明這些指標間有密切聯(lián)系.

圖11 不同加熱溫度和加熱時間的聚類分析(Group 1～Group 4分別代表依屬于不同距離函數(shù)的指標)

3 結語

熱處理使肌原纖維蛋白的巰基質(zhì)量摩爾濃度減少、紫外吸光度和濁度增大、熒光強度下降、Ca2+-ATPase活性下降.加熱溫度升高，肌原纖維蛋白的表面疏水性先增大后減小.熱處理使肌原纖維蛋白的α-螺旋比例減少，β-折疊和無規(guī)卷曲的比例增加.熱處理后的肌原纖維蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性先增后減.主成分和聚類分析表明蛋白質(zhì)的不同結構會對功能特性的影響是不同的.主成分分析表明α-螺旋、β-折疊、無規(guī)卷曲和乳化性被主成分介紹的程度高.可以通過設計不同加熱溫度和時間使肌原纖維蛋白的功能特性得到有效的發(fā)揮.