母 丹

（重慶市生物技術(shù)研究所有限責(zé)任公司 重慶 401121）

微生物限度檢查法是指檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受到微生物污染程度的方法[1]。反映了藥品從原料、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)設(shè)備、生產(chǎn)環(huán)境到實(shí)驗(yàn)操作者整個(gè)過程的衛(wèi)生狀況。微生物限度指標(biāo)是否符合《中國藥典》第四部中的相關(guān)規(guī)定直接決定著藥品最后合格與否，因而至關(guān)重要。下面將對容易引起誤差的幾個(gè)影響因素進(jìn)行分析。

一、分析資料與方法

（一）檢驗(yàn)資料

通過對2015年到2020年五年時(shí)間內(nèi)，1000種藥品微生物進(jìn)行限度檢查，其中包含了片劑、顆粒劑、膠囊劑、粉劑。觀察這1000種藥品微生物限度檢查時(shí)發(fā)生的誤差率及分析發(fā)生誤差的影響因素和分布，結(jié)果如下表1：

表1 誤差影響因素及分布

由表1顯示可知，微生物限度檢查的影響因素有很多，具體的影響因素將進(jìn)一步分析。

二、影響因素的分析

（一）操作環(huán)境對微生物限度的影響

微生物限度檢查應(yīng)有單獨(dú)的潔凈室，潔凈室內(nèi)應(yīng)設(shè)有無菌操作臺(tái)和空氣凈化系統(tǒng)，應(yīng)在不低于D級(jí)背景下的B級(jí)單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行[2]，應(yīng)定期按要求對潔凈室內(nèi)的潔凈度進(jìn)行驗(yàn)證。微生物內(nèi)容包括空氣中菌落總數(shù)、沉降菌、塵埃粒子、浮游菌，操作臺(tái)面、潔凈服微生物的檢測等。潔凈室內(nèi)應(yīng)帶有緩沖間，將無菌衣、無菌手套、口罩、鞋套放于緩沖間內(nèi)，緩沖間的門應(yīng)及時(shí)關(guān)閉且不能對開。潔凈室內(nèi)的溫度控制在26℃左右，相對濕度控制在40%-60%之間。每次操作前都應(yīng)打開紫外線燈進(jìn)行照射殺菌30min，每次操作前后都應(yīng)用75%的酒精或其他消毒液擦拭操作臺(tái)及可能污染的死角。操作臺(tái)應(yīng)備有天平、酒精燈、火柴、酒精棉球、助吸器等設(shè)備。當(dāng)初次檢驗(yàn)結(jié)果為陽性需要進(jìn)一步對陽性菌進(jìn)行鑒定時(shí)，應(yīng)在單獨(dú)的潔凈區(qū)內(nèi)，不能與供試品在同一個(gè)區(qū)域，以免引起交叉污染[3]。

當(dāng)進(jìn)行陽性菌接種時(shí)，整個(gè)過程都應(yīng)該在酒精燈旁完成。接種時(shí)按照以下步驟進(jìn)行：先燒接種環(huán)，待稍微冷卻及時(shí)沾取細(xì)菌樣品，然后在培養(yǎng)基上劃線接種，最后再給接種環(huán)滅菌。當(dāng)接種時(shí)有試管時(shí)，一定要給試管口及試管帽進(jìn)行滅菌，防止污染。

（二）設(shè)備及用具對微生物限度的影響

實(shí)驗(yàn)用所有器皿應(yīng)按玻璃器皿的清洗方法洗干凈烘干備用。用牛皮紙將實(shí)驗(yàn)所用器皿包裹密封后放于121℃的高壓滅菌鍋滅菌30min，滅菌完成后不能立即放置陰冷處，避免因急速冷卻使滅菌物品內(nèi)蒸汽冷凝造成負(fù)壓易染菌[4]，取出后應(yīng)放置在恒溫培養(yǎng)箱中烘干，待用。高壓滅菌鍋應(yīng)配有專職人員經(jīng)培訓(xùn)考試合格后持證上崗使用，避免使用過程中發(fā)生危險(xiǎn)。所有儀器設(shè)備都應(yīng)該按要求定期校準(zhǔn)鑒定，包括所用設(shè)備（天平、壓力容器、水浴鍋、操作臺(tái)、振搖器、培養(yǎng)箱等），每次使用都應(yīng)該填寫使用記錄，并定期進(jìn)行維護(hù)清理。值得注意的是，壓力容器的壓力表和溫度表都應(yīng)該定期檢驗(yàn)，以防溫度和壓力出現(xiàn)異常而導(dǎo)致滅菌不徹底從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外對于一些實(shí)驗(yàn)耗材也應(yīng)該定期校驗(yàn)，如燒杯、移液管或者加液槍，應(yīng)注意的是使用加液槍前應(yīng)該對其進(jìn)行計(jì)量驗(yàn)證，以保證實(shí)驗(yàn)過程中所加樣品量的準(zhǔn)確性。

（三）操作人員對微生物限度的影響

檢驗(yàn)人員應(yīng)該經(jīng)過崗前培訓(xùn)，考試合格后方能上崗，實(shí)驗(yàn)過程中要始終按照無菌檢查的要求進(jìn)行。此外操作人員還應(yīng)該定期進(jìn)行知識(shí)再教育，隨時(shí)關(guān)注行業(yè)新動(dòng)態(tài)，學(xué)習(xí)新的檢測標(biāo)準(zhǔn)、方法等。檢驗(yàn)人員的無菌服每次都應(yīng)進(jìn)行高壓滅菌處理，禁止把無菌服穿出潔凈區(qū)。實(shí)驗(yàn)前用肥皂水按照七步洗手法將手洗干凈，然后用75%的酒精進(jìn)行消毒，再戴上無菌手套。在緩沖間內(nèi)換上衣服，戴上鞋套、口罩然后進(jìn)入潔凈區(qū)。檢驗(yàn)人員在進(jìn)入無菌室后不要頻繁走動(dòng)，不能大聲喧嘩及嬉戲打鬧，不要咳嗽及打噴嚏，操作過程中如果需要傳遞物品，應(yīng)通過傳遞倉。無關(guān)人員禁止出入無菌室，減少污染機(jī)會(huì)。操作人員除了專業(yè)素養(yǎng)以外，還應(yīng)該具備一定的人文素養(yǎng)。操作人員本身應(yīng)該身體健康，不能有皮膚病及一些傳染疾病，以防污染實(shí)驗(yàn)結(jié)果。操作完成后應(yīng)及時(shí)清理操作臺(tái)及無菌間，避免滋生細(xì)菌污染環(huán)境。

（四）培養(yǎng)基對微生物限度的影響

1.培養(yǎng)基的儲(chǔ)存

實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基的質(zhì)量，直接影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性?，F(xiàn)在的培養(yǎng)基基本采用的是脫水培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)嚴(yán)格按照說明書上的條件進(jìn)行儲(chǔ)存，防止培養(yǎng)基吸潮結(jié)塊。應(yīng)使用在保質(zhì)期內(nèi)的培養(yǎng)基，超過保質(zhì)期雖未有明顯變化但依然會(huì)影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.培養(yǎng)基的配置使用

培養(yǎng)基每次應(yīng)按照供試品的量決定配置的多少，且只能經(jīng)過一次高壓滅菌。配置好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2-25℃，避光的環(huán)境。滅菌過后的培養(yǎng)基應(yīng)盡量避免過度加熱，以免造成營養(yǎng)成分破壞。使用前的培養(yǎng)基應(yīng)放置在（50±2℃）的水浴鍋或培養(yǎng)箱中，以防培養(yǎng)基在供試品稀釋液制備過程中冷凝。按梯度進(jìn)行制備樣品并加入到相應(yīng)梯度的培養(yǎng)皿中，然后將培養(yǎng)基緩緩傾倒入培養(yǎng)皿中并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，以便樣品分布均勻。此處培養(yǎng)基的溫度最好控制在45℃左右，因?yàn)闇囟冗^高可能殺死待檢品中的細(xì)菌，溫度過低又會(huì)造成凝固。待培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基冷凝后，把培養(yǎng)皿倒置放于符合培養(yǎng)要求的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

3.培養(yǎng)基的檢查

實(shí)驗(yàn)用的培養(yǎng)基都應(yīng)按照《中國藥典》第四部通則1101無菌檢查法中的要求做培養(yǎng)基的無菌性檢查，且每批培養(yǎng)基的無菌檢查結(jié)果必須為無菌生長方可使用。另外還應(yīng)按此通則做培養(yǎng)基的靈敏度檢查，需注意的是用于培養(yǎng)基靈敏度檢查的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的干燥菌種為0代）[5]。

（五）供試液制備過程對微生物限度的影響

1.供試液的制備

供試品檢驗(yàn)的整個(gè)過程必須符合《中國藥典》中無菌檢測的要求。按照被檢測菌種相關(guān)技術(shù)要求，按1∶10的比例稱取定量的供試品加入到滅菌后的稀釋液中，再放入均質(zhì)器中振搖均勻，此溶液為10倍供試液。取1ml混合均勻的10倍供試液加入到9ml滅菌后的稀釋液中，應(yīng)用助吸器和移液管反復(fù)吹打以混勻，此溶液為100倍供試液。按照100倍供試液的方法制備1000倍供試液，三種溶液制備完成后待用。

2.實(shí)驗(yàn)過程

對應(yīng)三個(gè)梯度的供試液準(zhǔn)備相應(yīng)的培養(yǎng)皿，每個(gè)梯度需要2個(gè)培養(yǎng)皿，計(jì)數(shù)結(jié)果以平均值為準(zhǔn)。取1ml上述制備好的供試液加入到相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，需注意每次移取供試液時(shí)都應(yīng)混勻，否則取上清液或沉淀物都將會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。然后再倒入15-20ml溫度不超過45℃的培養(yǎng)基，并使供試液和培養(yǎng)基充分混勻，防止細(xì)菌成片或重疊生產(chǎn)，影響計(jì)數(shù)。從制備供試液到注入培養(yǎng)基操作人員應(yīng)該熟練迅速完成，整個(gè)過程應(yīng)盡量控制在1h內(nèi)，因?yàn)椴僮鲿r(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致微生物繁殖或死亡影響結(jié)果計(jì)數(shù)。供試品、稀釋液、培養(yǎng)基必須定量加入，使檢查標(biāo)準(zhǔn)化，以便控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5]，千萬不能估量取樣。應(yīng)在與供試品制備相同實(shí)驗(yàn)條件下設(shè)置陰性對照組且陰性對照組不能生長菌落數(shù)，否則本次實(shí)驗(yàn)無效。

（六）樣品的影響

檢測過程中應(yīng)注意被檢樣品的特殊性，不同的樣品對微生物的影響也會(huì)不同。藥品對外來微生物的污染可多可少，種類繁多。注意被檢樣品中抑制微生物生長的成分。根據(jù)平時(shí)工作經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)很多藥品中有抑制微生物生長的成分，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)考慮這一因素。不同樣品對溫度的感知也會(huì)出現(xiàn)差別。有的檢品在規(guī)定培養(yǎng)溫度下的生長較為緩慢，這時(shí)就應(yīng)該延長培養(yǎng)時(shí)間來計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。在抽取被檢樣品時(shí)應(yīng)具有隨機(jī)性、代表性、可疑性。

（七）菌種及菌落計(jì)數(shù)

不同菌種培養(yǎng)的時(shí)間和條件會(huì)有所不同，應(yīng)按相關(guān)技術(shù)規(guī)定培養(yǎng)。菌種計(jì)數(shù)是以肉眼直接點(diǎn)計(jì)，故要求檢驗(yàn)人員仔細(xì)觀察，可以借用放大鏡等外來工具。應(yīng)選用菌落數(shù)在適宜范圍內(nèi)的培養(yǎng)皿來觀察計(jì)數(shù)，并取兩個(gè)培養(yǎng)皿菌落數(shù)的平均值作為該梯度的最后結(jié)果。根據(jù)藥典規(guī)定蔓延生長的培養(yǎng)皿不宜計(jì)數(shù)，檢驗(yàn)人員在計(jì)數(shù)時(shí)要注意鑒別培養(yǎng)基的氣泡、供試品沉淀物、顆粒等，應(yīng)注意培養(yǎng)基邊緣的菌落，以防多計(jì)或漏計(jì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)培養(yǎng)基中菌落數(shù)較多不易點(diǎn)計(jì)時(shí)，可將培養(yǎng)基平均分為四個(gè)區(qū)域，計(jì)數(shù)其中一個(gè)區(qū)域的菌落數(shù)然后乘以四作為該平板的最后計(jì)數(shù)結(jié)果。

計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)注意平板邊緣和瓊脂內(nèi)的菌落，以防漏記。計(jì)數(shù)過程中遇到有爭議時(shí)可以用放大鏡觀察或者在低倍顯微鏡下直接觀察，亦可挑取可疑菌落涂片后鏡檢，也可以適當(dāng)?shù)匮娱L培養(yǎng)時(shí)間以便觀察計(jì)數(shù)。

實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)。但是當(dāng)出現(xiàn)蔓延生長趨勢時(shí)，菌落總數(shù)點(diǎn)計(jì)要從24小時(shí)開始觀察計(jì)數(shù)，霉菌、酵母菌從48小時(shí)開始觀察計(jì)數(shù)，最終結(jié)果菌落總數(shù)還是以48小時(shí)計(jì)數(shù)結(jié)果為準(zhǔn)，霉菌、酵母菌以72小時(shí)計(jì)數(shù)結(jié)果為準(zhǔn)。

（八）實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

微生物限度檢查的實(shí)驗(yàn)中，操作人員應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

1.微生物限度檢查不允許復(fù)測，均以第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。

2.供試品取樣應(yīng)具有代表性，應(yīng)按照相關(guān)規(guī)定的方法取樣再加以混合。

3.整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程要牢記無菌觀念，以防外來污染。

4.實(shí)驗(yàn)中應(yīng)做好標(biāo)記，以防混淆。

5.片劑應(yīng)用滅菌烘干的乳缽研磨成粉末后再檢測；膠囊劑應(yīng)加入45℃的稀釋液中并且放置在水浴中保溫、振搖，使膠囊充分溶解后再進(jìn)行檢測；凝固很快的樣品應(yīng)在加快操作者的速度，必要時(shí)可以考慮加大稀釋倍數(shù)。

6.實(shí)驗(yàn)室所用的純凈水應(yīng)該定期檢驗(yàn)，應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)用水要求，每次實(shí)驗(yàn)的器皿應(yīng)及時(shí)清洗，實(shí)驗(yàn)室所用消毒劑應(yīng)經(jīng)常更換，以防產(chǎn)生耐受菌。

7.為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在對藥品進(jìn)行微生物檢查實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證。

三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

待測樣品：100g/袋破壁靈芝孢子粉

檢測項(xiàng)目：菌落總數(shù)、霉菌、酵母菌、大腸菌群

試劑：平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基 無菌生理鹽水

實(shí)驗(yàn)步驟：1.稱取25g樣品加入到225ml生理鹽水的無菌均質(zhì)杯中，1000r/min均質(zhì)2min，制成1∶10的樣品勻液。2.用1ml的無菌加樣器吸取1ml1∶10的樣品沿著杯壁緩慢加入到含有9ml生理鹽水稀釋液的試管中，震蕩試管制成1∶100的樣品勻液。注意加樣時(shí)吸頭不要接觸稀釋液面。3.按照“2”的方法制備10倍稀釋液，得1∶1000的樣品勻液。沒增加一個(gè)梯度的稀釋液注意標(biāo)記以防混淆，不同梯度需要換一個(gè)吸頭以防污染。4.分別吸取1ml制得的三個(gè)梯度稀釋液注入到無菌平皿中，每個(gè)梯度2個(gè)平皿。再分別吸取1ml生理鹽水注入到2個(gè)空白無菌平皿中，作為空白對照。各梯度平皿應(yīng)做好標(biāo)記。5.迅速傾倒15-20ml冷卻到45℃±1℃平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，緩緩轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。6.待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)于36℃±1℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h。7.選取菌落數(shù)在30CFU-300 CFU之間的，無蔓延菌落生長的平皿計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的記錄實(shí)際菌落數(shù)，大于300CFU的可計(jì)為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的采用兩個(gè)平皿的平均值作為最終計(jì)數(shù)。8.按照菌落總數(shù)的操作方法同理操作霉菌和酵母菌，培養(yǎng)基用孟加拉紅培養(yǎng)基；大腸菌群用無菌試管替代平皿，培養(yǎng)基用月桂基硫酸鹽胰蛋白胨。

菌落總數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表2

稀釋度 10-1 10-2 10-3 空白菌落數(shù) 10 8 1 1 0 0 0 0平均數(shù) 9 1 0 0檢驗(yàn)結(jié)果（CFU/g） 90

霉菌、酵母菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表3

稀釋度 10-1 10-2 10-3 空白菌落數(shù) 0 0 0 0 0 0 0 0平均數(shù) 0 0 0 0檢驗(yàn)結(jié)果（CFU/g） ＜10

大腸菌群實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表4

稀釋度 LST BGLB 0.1mL（g）×3 - - -0.01mL（g）×3 - - -0.001mL（g）×3 - - -檢驗(yàn)結(jié)果MPN/100g ＜0.3

四、結(jié)論

綜上所述，微生物限度檢查的結(jié)果受多方面因素的影響，從環(huán)境、設(shè)備、人員到培養(yǎng)基、供試品、菌種及菌落計(jì)數(shù)等，每一個(gè)環(huán)節(jié)都有可能影響微生物的最終結(jié)果，因此加強(qiáng)對微生物限度檢查實(shí)驗(yàn)過程的質(zhì)量控制顯得尤其重要，也是今后實(shí)驗(yàn)中保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的一個(gè)重要手段。